醫學研究部(Department
of Medical Research)共 同 研 究 室 電 子 報
第六十二期 FEB.10.2019
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自由基是一個研究的老議題，環境中充斥著自由基。但自由基怎麼產生怎麼消失？許多研究報告探討箇中奧祕，但往往說不清楚，讀者也看不明白。這與研究自由基的方法有關，下面向各位讀者介紹一個自由基偵測方法，被認為是目前自由基檢測最直接有效且新穎的方法。下一期電子報將介紹「內毒素檢測」，敬請期待，並竭誠歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器介紹、研究新知、與每月訓練課程資訊，更歡迎您與我們聯絡，給予我們建議與鼓勵。
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什麼是自由基？
自由基（Free Radical），又稱游離基，是指化合物的分子在光熱等外界條件下，共價鍵發生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團。在書寫時，一般在原子符號或者原子團符號旁邊加上一個「•」表示沒有成對的電子。如氫自由基（H•）、氯自由基（Cl•）、氫氧自由基(•OH)，甲基自由基（CH3•）等。
正常的化學物質是由原子構成的分子，同時攜帶成對電子來維持其化學狀態的安定；而自由基即是含有不成對電子的原子或分子，因此它會搶奪其它原子或分子的電子來湊對，才能轉為安定狀態。
氧是生命運動過程中不可缺少的一種氣體，自從1770 年代初英國人Joseph Priestley 發現氧以來, 氧一直被人們認為是一種對人體百益而無一害的氣體。 可是今天我們知道, 不管是空氣中的氧還是水中的溶解氧都具有較高的氧化性，與鐵一樣，處於空氣中的人體各部位都會被氧化而「生銹」，當然這種生銹與鐵生銹不同，它體現在人體的細胞上， 特別是人體的器官隨著年齡而老化更是這種「生銹」的直觀表現。
活性氧物質 (Reactive oxygen species；ROS)是人體內氧化代謝過程及自然防禦系統中，所產生具有高度活性的物質。活性氧物質又分為含氧自由基及非自由基 (圖一)，而自由基 (Free Radical) 定義為具獨立不成對電子的原子、分子或離子，例如H•、•OH 、O2 -•、HO2•、NO、NO2，而含氧自由基則定義為氧氣在體內代謝之後所衍生出活性高、攻擊性強的氧氣化合物，如：1O2、•O2-、•OH、H2O2。
一般來說，ROS主要可以分成四大類：
(1).超氧化物陰離子 (O2-．)
(2).氫氧自由基 (•OH)
(3).過氧化氫 (H2O2)
(4).單重態氧 (Singlet Oxygen, 1O2)
圖一、活性氧物質 (ROS)分類
ROS除了環境中的空氣污染、離子輻射、抽菸和化學物質都會引發以外；人體內正常代謝的氧化反應也會產生活性氧，粒腺體是身體中活性氧的一個重要來源，呼吸作用過程中 98% 的氧氣會在細胞內產生能量，但是約 2% 會成為活性氧，活性氧都是有氧代謝的副產物。體內的活性氧並不總是有害的，它對身體也有益處的。例如吞噬細胞在細胞膜受到刺激時，會產生大量活性氧來保護我們的身體，ROS 是吞噬細胞發揮吞噬和殺傷作用的主要介質。
適量的活性氧是維持正常生理機能所必需，如參與氧化還原等生化反應、剷除外來病菌、與訊息傳遞等；反觀，過量的活性氧卻是具有危害性，如影響生理恆定、破壞 生物分子結構、毒殺正常細胞與促使基因突變等，因此，自由基可具有保護與傷害的雙重效應。當自由基過度產生時會造成與體內的抗氧化防禦機轉(Antioxidant Defense Mechanisms)之間的不平衡，進而導致氧化壓力(Oxidative Stress)的發生，許多研究證據指出氧化壓力對現代化慢性病的發生具重要的角色，如氣喘(Asthma)、腎病(Nephropathy)、糖尿病 (Diabetes Mellitus)、癌症(Cancer)、心臟血管疾病(Cardiovascular Diseases)、 愛滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome)與老化(Aging)等，在神經系統的慢性病，如中風(Stroke)、老年癡呆症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、亨丁頓氏症(Huntington's disease)等。
由於活性氧具有較高的反應活性，它們可以與許多不同的化合物發生化學反應，由此產生各種不同的反應生成物，根據這些反應生成物或者反應物的變化程度可以進行定量及定性分析。通常採用的分析方法有：化學冷光法、螢光光度法和電子順磁共振等方法。
化學冷光法是活性氧檢測中最常用到的實驗技術，其原理是化學冷光試劑與活性氧反應生成激發態的產物，產物中的電子經非輻射性躍遷回到基態而放出光子。常用的化學發光試劑有魯米諾(Luminol)、光澤精(Lucigenin)和海螢螢光素（Cypridina Luciferin Analog，CLA）活性氧的化學發光研究也是活性氧測定法研究領域中比較常用的方法，但是常有專一性不足的問題造成研究人員的困擾。
電子順磁共振法（Electron Paramagnetic Resonance）
與其他測試方法相比，EPR是觀察和檢測活性氧最直接和最有效的方法。EPR所具有的獨特性越來越受到重視，成為檢測和識別活性氧不可缺少的工具。作為活性氧的化學反應後的檢測方法，可以理解成是一種自由基的標識反應, 即向活性氧生成的反應體系中添加本身帶有不對稱電子的自由基, 這一添加物與不同的活性氧種類發生反應而導致EPR 信號的變化來定性是那一種活性氧及定量每一種活性氧的含量。
電子順磁共振(Elecron Paramagnetic Resonance, EPR)，又稱為電子自旋共振（Electron Spin Resonance, ESR）是唯一可檢測含有未成對電子物質的光譜學技術。在我們生活上碰到自由基的機會相當多。如圖二所示, 每天呼吸的氧氣、早上起床喝的咖啡、早餐吃的貝果..這些材料內部都存在自由基。自由基的壽命通常很短，但它們在生命的過程中發揮著至關重要的作用，比如光合作用、氧化作用、催化作用、聚合反應等等。 因此，EPR是一種跨越多個學科的技術，包括化學、物理學、生物學、材料科學、醫學等。
圖二、每天生活上你所碰到的自由基
EPR可以提供哪些資訊？
目前，只有EPR技術可以明確檢測未成對電子。螢光檢測等其它技術只能提供有關自由基的間接證據，只有EPR才能確切地證明自由基的存在。 此外，EPR還擁有檢出並鑑定順磁物質的獨特能力。EPR樣品對局部環境非常敏感。 因此，該技術可提供有關未成對電子附近的分子結構的資訊。EPR譜有時還會呈現劇烈的譜線形狀變化，這有利於分析人員深入研究分子運動或流動性等動態過程。EPR自旋捕獲技術可檢測短壽命的活潑自由基，是利用EPR技術檢測和鑒定自由基的一個範例。 該技術在生物醫學領域一直以來都至關重要，被廣泛用於研究自由基的病理學和毒理學作用。EPR自旋標記是生物化學家常用的一項技術，它使用順磁分子（即自旋標記）來“標記”特定區域的大分子。 根據自旋標記物的EPR譜，生物化學家可確定自旋標記處於怎樣的環境下（疏水性、酸鹼度、流動性等）。
EPR的工作原理
EPR是一種磁共振技術，與核磁共振（NMR）非常相似。
但是，該技術不是測量樣品中的原子核躍遷，而是檢測未成對電子在外加磁場中的躍遷。
電子和質子一樣會有“自旋”，所以擁有“磁矩”這種磁屬性。
磁矩會使電子形成類似小磁條的排布，就像您貼在冰箱上冰箱貼那樣。
當我們施加外部磁場時，電子會因為其自旋而產生方向不同的磁矩與磁場平行或反平行的方向排列分布。這會使電子產生兩種能量不同的能階，而當電子被分為兩個能階時，我們便可以用微波(Microwave)將低能階的電子激發到高能階而產生EPR的信號。
起初，處於低能階（即與磁場平行的）電子較多，而高能階（反平行）電子較少。
我們使用固定頻率的微波輻射來激發低能階的電子，使其躍遷到高能階。為了使躍遷發生，我們還必須讓外部磁場保持特定的強度，使得低能階和高能階之間的能級間隔完全符合我們外加的微波頻率，共振的條件根據hv
= gβB的公式。為了創造上述條件，需要將樣品置於固定頻率微波，掃描外部磁場。如果磁場(B)和微波頻率(v)“完全符合”，則可產生EPR共振。因所使用微波頻率的不同，又可區分為L
Band、S
Band、X
Band、K
Band、Q
Band 及W
Band的EPR，表一是不同頻道所使用的頻率。
不同的應用會用到不同的EPR 頻道，基本上自由基的應用都是使用X Band。
EPR 由磁鐵、主機和電腦組成如圖三
圖三、EPR光譜儀的結構
使用自旋捕捉劑（Spin Trap）檢測自由基(ROS)
電子順磁共振技術（Electron Paramagnetic Resonance，EPR）是一種檢測自由基的方法，由於O2-·、· OH等自由基的反應活性很高因此很難維持長時間的穩定而難以檢測，EPR與自旋捕捉技術（Spin Trap）相結合可解決這個問題。首先自旋捕捉劑與自由基反應生成相對穩定的自由基附加生成物，就可以用EPR進行測定自由基的分析。
自旋捕捉劑一些含有NO官能基的化合物通常是硝酮基(Nitrone)或亞硝基(Nitroso)的化合物，這類化合物沒有自由電子因此與自由基反應成為附加生成物前EPR 是檢測不到，另外這類化合物很穩定不容易被氧化或還原。自旋捕捉劑與自由基反應會形成含穩定自由電子的附加生成物，這些穩定的化合物就可以被EPR檢測。常用的自旋捕捉劑如表二， EPR 的好處是不同的自由基與同一自旋捕捉劑會形成不同的特性吸收，如此一來我們就可以分辨超氧化物陰離子 (O2-．)和氫氧自由基 (•OH)。如圖四所示:
有些自旋捕捉劑對細胞沒有毒性因此可以檢測細胞內的自由基信號，能分辨不同的ROS是EPR的最大優點，尤其是與自旋捕捉技術相結合提高了檢測方法的靈敏度及定性分析的可信度，擴大了其應用範圍。
表二、EPR因激發頻率的不同而有不同的頻道
圖四、DMPO
與不同的自由基反應後的EPR
光譜不同
圖五所顯示的就是如何使用EPR 來檢測ROS
圖五、用EPR
檢測ROS
的Protocol
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