醫學研究部共同研究室

本期電子報介紹細胞行為儀 (Electric Cell-substrate Impedance Sensing; ECIS)也稱為細胞電阻抗檢測儀，希望能以簡單有趣的方式介紹這個儀器。Journal of Visualized Experiement (JOVE)在2014年出刊一篇ECIS的文章，以影片的方式介紹ECIS 的使用方法和結果呈現，本期電子報將內容精簡為ECIS的簡介和使用篇章。本期科學新知部份則以一篇2014年論文為基礎，呈現從實驗想法到實驗如何落實，在過程中細胞行為儀如何參與這個實驗，ECIS又能夠幫忙解決那些問題，如何展現數據和統計分析，及ECIS在其它研究上的運用，並且說明如何將ECIS和耗氧儀做一個實驗上的搭配。總而言之，以二篇論文介紹一台儀器的操作和運用，並將另一台耗氧儀串連應用一起介紹，希望能引起各位讀者的興趣，並且能對研究有所助益。下一期電子報將介紹ELISA reader，此系統是藉由抗原與抗體反應後，利用不同染劑進行分析的方式，適用可見光、螢光及冷光等偵測光源，另外也將介紹動力分析儀偵測內毒素的新式定量檢測法，及細胞治療的最新發展，有興趣的同仁請密切注意下期的電子報喔！歡迎您訂閱共同研究室電子報以獲得相關訊息。同仁對於共同研究室如有其他新的研究服務需求，更歡迎您與我們聯絡，給我們建議與鼓勵。

1. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. 28(85). doi: 10.3791/51300, 2014 (影片網址：http://www.jove.com/video/51300/electric-cell-substrate-impedance-sensing-for-quantification )。本篇是影片期刊，可點進去看細胞行為儀如何在實驗前做準備，如何操作及設定細胞儀，紀錄的訊號如何呈現和代表涵意，影片中一些重要關鍵字也可在期刊文章中找到。

2. Mizoribine inhibits the proliferation of renal stem progenitor cells by G1/S arrest during renal regeneration Acta Med. Okayama, 68(1):7-15, 2014。本篇是細胞實驗如何配合動物實驗去證實一個科學現象，細胞行為儀在實驗中有那些幫助，且有分析細胞行為儀圖形的統計方法。

為協助醫學校區學術研究，醫學研究部在2014年已設置了配備有三支雷射的cell sorter，並聘任專職技術師楊凱婷小姐 (ntuhsorter@ntuh.gov.tw)負責相關業務，現正實施優惠活動：期間使用三個時段贈送一個時段，還有機會獲得神秘小禮物。正熱切開放服務中，歡迎大家多加利用(預約規則請參閱醫研部網站)。

TOP

細胞行為儀技術原理為1973年諾貝爾物理學獎得主Ivar Giaever教授和他的同事Charles R. Keese教授於1984年共同研發出來，大大簡化了细胞動態行為的研究，擴大了研究範圍。目前的機型和配件如下圖所示，含一台主機，電腦和晶片架(array holder)。

利用細胞行為儀，需要搭配八孔(wells)細胞培養盤。每一個well都有數個微小金屬電極(5x10^-4 cm²) ，可以傳導微弱的交流訊號測量其電阻。在沒有細胞時，電流無限制循環流動於電極表面，造成低電阻。當細胞接觸並伸展覆蓋於這些電極時，絕緣的細胞膜會使電流在細胞下或細胞間流動，而阻礙了電流的循環流動，造成電阻的上升如下圖所示。

電阻的結果快速被測量並用於分析細胞的行為，獲得對於細胞行為的即時以及高敏感度的量化資料。細胞行為儀主要是量化細胞的生長速度，細胞與細胞之間的緊密程度（barrier function）和細胞位移的速度。另外，也有許多研究者用來研究細胞特性的改變，例如幹細胞分化成骨細胞或脂肪細胞，在細胞行為儀上，它們的生長行為可以被明顯區分出來。

細胞行為儀的使用(這個部份建議讀者觀看影片)

細胞行為儀的耗材是一種含8個wells底部舖金鉑的電極晶片。
在使用前先加入L-cysteine穩定晶片，之後再加入gelatin以方便細胞附著。
將wells填充細胞培養液後，置入特製的晶片架，設定儀器參數。
參數設定完畢之後，加入細胞，就可以進行實驗了。

經過上述的設定之後，以第一篇期刊的圖（見下）說明細胞行為儀訊息的呈現。

細胞在晶片中生長到舖滿的時侯，細胞層的阻力(impedance)是逐漸爬升一直到水平狀態，也就是圖中AB階段。
在C階段，設定細胞行為儀給予電擊而造成細胞死亡，可觀察到阻力因細胞死亡而迅速下降，但而隨著細胞長回填滿電擊區，阻力又恢復。
在D階段，因實驗所用是內皮細胞，加入凝血酶(thrombin)促使細胞收縮，增加了細胞與細胞之間的孔隙而使阻力徒降。

所以細胞行為儀展現實驗結果是以曲線的方式，凡舉細胞生長、生病、死亡，細胞行為儀都可記錄。

TOP 　

科學新知

藥物對腎臟幹細胞生長抑制之探討

醫學研究部于家城博士

腎臟病在世界各地都是一嚴重問題，在台灣洗腎人口更是世界第一。對於腎臟組織遇到損傷，幹細胞和先祖細胞（progenitor cell）能協助腎臟組織恢復到何程度，到目前為止還是個謎，如果讓免疫細胞進入腎組織，則可造成腎組織的纖維化，有可能阻礙幹細胞或先祖細胞重建腎組織，故需使用免疫抑制劑抑制發炎反應。但若使用了免疫製劑會讓幹細胞或先祖細胞喪失複製能力，那不也是會讓損傷的腎臟無法恢復？本篇作者挑選了三種免疫抑制劑， Mizoribine（MZR）、cyclophosphamide（CPA）和cyclosporine（CyA），以細胞行為儀來偵測腎組織細胞或幹細胞生長是否受免疫製劑的影響。實驗使用三種代表性的細胞株，分別是(1)NRK-52E cells﹕混合型大鼠腎臟上皮細胞，(2)UB（ureteric bud）﹕腎臟在胚胎發育時期的腎芽細胞，(3)rks56 cells﹕從大鼠腎小管上分離出來的可分裂細胞，其中(2)，(3)分別可代表幹／先祖細胞，而(1)則代表一般腎組織細胞，經過細胞培養和將細胞養在細胞行為儀測試結果如下：(參考下圖)

紅框：NRK cell；藍框：UB cell；綠框：rks56 cell。四個圖分別是用四種不同濃度的MZR(0, 0.1, 1, 10 µg/ml)處理培養細胞。高濃度(1, 10 µg/ml)通常讓三種細胞都無法生長。這個細胞影像的結果和下圖細胞行為儀記錄的結果類似。在細胞行為儀的曲線當中，曲線走向升高，代表細胞層有生長，電阻也升高，反之，細胞没有長起來，行為儀的曲線就一直平坦沒有爬升的現象。注意曲線的統計方法，有興趣讀者，請參考原文。或許會有讀者會問，我們只要上部顯微影像的圖就好，為何還要下面行為儀的圖呢？細胞行為儀是即時、多點、多天記錄，而影像只是單點記錄。單點記錄可能因時間點選的不好，因而誤判。

再看看動物方面的研究，無論細胞方面的結果再怎麼好，總是要在動物或臨床上去印證。使用的大鼠腎損傷模式是夾住腎動脈40分鐘，讓腎組織缺氧和缺營養物質，然後再供血。組織突然又承受大量氧並產生自由基以致於破壞腎組織，造成腎損傷。動物分三組，第一組只動手術，不觸及腎臟。也就是圖A(見下面組織切片圖)。第二組腹腔剖開之後，找到腎動脈，用夾子阻斷腎血流40分鐘，然後放開，結果呈現在圖B。第三組是夾動脈之後，再給予6天的MZR藥物，呈現在圖C。這三組大鼠都在處理後第七天犠牲。其中圖C切片有許多腎臟組織空洞化。作者認為這是損傷的組織沒有被修補好。當然，這樣的組織切片證據也許被人嫌薄弱。作者又用了細胞分裂的指標Histone和Nestin來染組織切片，結果如下：A、B、C圖的定義同上面所述，多出的D、E圖是分別給予CPA和CyA藥物6天，CPA和CyA在細胞行為儀無法證明抑制腎臟細胞增生，所以在活體組織染色也看到細胞分裂修補旺盛，如B、D、E。而MZR則看不到如此旺盛的修補。到此實驗就可劃下完美的句點，因為動物實驗和細胞行為儀所顯示的結果一致。

通常有細胞方面的研究成果，再加上動物或臨床上的應用，投期刊被接受度就很高，而這篇正是這種模式簡單易懂的範例。另外，還有對細胞行為儀曲線的統計模式，值得參考。

除了本篇論文所用到的實驗之外，細胞行為儀還可以用在測量藥物的訊息傳遞，有關細胞的死亡、增生、爬行、轉變成另一種細胞、細胞與細胞結合（tight junction）力強弱，細胞與外界貼附力強弱，腫瘤細胞轉移的研究等，有興趣的讀者，歡迎蒞臨醫學研究部第八共同研究室，我們有美國原廠專員和台灣代理商教學的錄音和錄影提供使用者參考，研究人員還可提供研究諮詢，歡迎使用指教。

細胞耗氧儀

細胞耗氧儀是設計用來測量粒線體(mitochondria)或細胞懸浮液(cell suspensions)樣本的呼吸速率(respiration rate)。整台儀器的外觀如下所示：

以Mitocell(MT200)耗氧儀為例，儀器上半部是玻璃圍成的呼吸小室（respiration chamber），下半部則是一個磁攪拌器，可以使呼吸小室內的攪拌棒旋轉，使細胞均勻懸浮。大約0.5 ml的細胞液(10⁶ cells)加入呼吸小室後，上面蓋上一個活塞型栓子(plunger)，阻隔呼吸小室的細胞與外界氧氣的接觸，細胞只能消耗呼吸小室0.5 ml液體剩餘氧氣，氧氣減少的速率可在電腦上記錄。栓子上有小孔，可允許實驗中添加藥物。實驗數據的呈現如下圖紅色曲線所示。二條黑色線之間的斜率儀器可幫我們算出，斜率大的耗氧量高，斜率小的耗氧量低。

細胞行為儀和耗氧儀的量測功能若互相串聯，可提供細胞行為更進一步的研究利器，但因耗氧儀必須使用懸浮細胞，而細胞行為儀必須使用貼附細胞，目前尚缺乏有利的串聯工具。明年第七共研將引進更先進的海馬生物能量儀設備，或許可以排除二者的差異性，將儀器做整合，提供更優化的實驗模式和方法。

TOP 　

共同研究室貴重儀器訓練暨研究新知課程　

儀器訓練課程:課程網路報名

	9月17日	多功能微盤分析儀原理與應用之教育訓練
	9月24日	全自動高速細胞分選儀(AutoMACS)儀器介紹與應用課程

研究新知課程:課程網路報名　

	9月04日	Illumina新世代定序儀之技術與應用介紹
	9月11日	次世代定序技術在腫瘤診斷上的臨床應用
	9月18日	實驗用超純水的原理、應用及重要觀念
	10月08日	器械預清潔及污染源去除介紹

歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器訓練與研究新知課程講習相關資訊。

TOP

為持續提供優質之研究服務，便於日後聘用專職技術人員、購置新儀器、現有儀器汰舊換新與維護保養等等，敬請於使用共同研究室資源並發表論文時，於論文致謝（Acknowledgement）處加入致謝共同研究室之文句，並於論文發表時通知共同研究室管理人員。致謝文句請依實際使用情形書寫，或請參考以下範例：We thank the staff of the Core Labs, Department of Medical Research, National Taiwan University Hospital for technical support.
　