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第九十八期 FEB.10.2022

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主編的話

研究服務公告

海馬生物能量儀進階應用介紹--脂肪酸代謝

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臺大醫院細胞治療案概況及申請流程

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主編的話

脂肪的代謝是生物體產生能量的來源之一,但要研究其代謝路徑及反應並不容易,脂肪酸的氧化作用位在粒線體,本期電子報將為大家介紹第七共研免疫研究核心之海馬生物能量儀,應用於肪酸代謝的研究方法及相關文獻,期望大家在脂肪代謝研究能有更進一步的認識。下一期電子報主題為「臺大醫院細胞治療案概況及申請流程」,敬請期待,並竭誠歡迎您訂閱共同研究室電子報收取儀器介紹、研究新知、與每月訓練課程資訊,更歡迎您與我們聯絡,給予我們建議與鼓勵。


研究服務公告

共同研究室免疫研究核心新進一台高通量螢光影像系統(ImageXpress NANO),能進行自動化多孔盤及玻片的快速影像掃描,並可進行長時間的活細胞影像拍攝,歡迎有興趣分析使用的同仁,洽詢免疫核心儀器技術專員(分機63299)預約使用。另顯微影像核心之正立式共軛焦顯微鏡(Leica SP8X)因系統模組故障,目前暫停服務,需待原廠維修模組製造出貨後維修。因現行疫情影響,原廠維修模組產製出貨期未定,伺系統維修完成後再行公告恢復服務。希望我們所提供的訊息對您的研究有所助益,服務品質也令您滿意,為了共研長期的經營運作,請您於發表文章時惠予致謝共同研究室,作為服務成效評鑑之用。
 
                                        
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海馬生物能量儀進階應用介紹--脂肪酸代謝
 

尚博生物科技 周家豪專案經理

脂肪,現代人囤積太多的東西;因此了解脂肪如何代謝,研究如何提高脂肪代謝便成為熱門的主題。傳統研究脂肪代謝的方法為同位素標定來追蹤脂肪代謝,但同位素在操作上有危險性,因此除了需要專業的空間和訓練之外,還要定期檢測實驗人員的健康狀況。

幸運的是脂肪酸會藉由粒線體代謝,因此藉由海馬生物能量儀偵測耗氧便可以安全、方便且快速的研究不同條件下脂肪酸代謝的差別。且由於同位素的測量方法是累計的方式,因此組別間的差異反而不如海馬實驗的結果好,因此您若有脂肪代謝的實驗需求,海馬生物能量儀將是您最好的選擇。

實驗設計分為1.BSA控制組 2.palm,16C棕櫚酸 3.palm + met (metformin糖尿病藥物;研究已證實為促進脂肪酸代謝)

(A)海馬實驗:可以在同一盤比較多個條件,且藉由自動注藥比較加入藥物的影響;第一次注藥可觀察到組別間因為處理不同有不同程度的耗氧提升,palm + met有最佳的反應,次之為palmBSA則沒有反應;最後加入ETO (etomoxir,抑制脂肪酸進入粒線體),可確認被抑制的訊號為脂肪酸代謝。


(B)測量9,10-3H-palmitic acid氧化後所產生的3HOH累積的情形;兩邊的實驗皆得到一致的趨勢,但海馬實驗可呈現更顯著的差異。

然而實際上進行脂肪酸實驗會面臨到許多困難,若沒有將這些困難一一克服,實驗室將無法得到正確的結果,這些需要克服的困難如下:

困難一:我平常養細胞並沒有餵細胞脂肪,我做實驗需要餵嗎?

解答一:

若細胞會合成脂肪提供給自己代謝,加入Eto便可區分脂肪酸代謝的耗氧,此部分屬於內生性脂肪酸代謝;而完整的實驗必須要額外加入脂肪酸才可以評估外生性的脂肪酸耗氧。
藉由粒線體壓力測試與不同組別的實驗設計,可有效區分外生性與內生性脂肪酸的比例;但大部分的細胞並無內生性脂肪酸。

困難二:脂肪酸應該怎麼加才正確? 為何我加入脂肪酸濃度越高細胞死亡率越高?

解答二:

由於脂肪酸不溶於水,因此必須與BSA進行鍵結才可有效提高溶解度,與BSA鍵結需要長時間的攪拌,不同階段攪拌的溫度也有所不同;且在結構上一分子的BSA僅能與六分子的棕櫚酸結合,因此若濃度或是過程不正確還會同時產生許多free fatty acid;因此實驗室若無正確鍵結BSA-Palm,隨著濃度越高會有越多free fatty acid造成細胞氧化壓力,這也是為何隨著加入脂肪酸濃度越高,細胞死亡率也隨之增加的原因。
Agilent Seahorse提供確實與BSA鍵結的16C棕櫚酸,且每批號會測量free fatty acid濃度,以確保對細胞不會有不良影響。

困難三:代謝的優先順序是碳水化合物>脂肪>蛋白質,我要如何設計實驗?

解答三:

為了讓細胞在實驗進行時可以確實進行脂肪酸代謝,實驗前會先將細胞置於substrate-limited medium (0.5 mM glucose),讓細胞處於糖近乎耗盡的狀態一陣子,而這段時間的長度需視細胞代謝特徵而定,例如癌症細胞因為過於依賴glucose,因此時間需較短,約4小時即可;若屬於較不依賴glucose的心肌細胞,則需處在此環境隔夜才有較好的效果;之後才會置換成海馬上機用培養基正式進行測試。
脂肪酸代謝屬於難度較高的實驗,建議已有粒線體壓力測試的經驗再進行;原廠提供了完整的操作流程文件與相對應的試劑,也提供良好的技術支援,若您有此實驗的需求,歡迎與我們聯絡!

脂肪酸代謝在不同的細胞上扮演了不同的重要角色,最後與大家分享於2017年發表於Nature文獻上的有趣發現。

Survival of tissue-resident memory T cells requires exogenous lipid uptake and metabolism / Nature. 2017 Mar 09, 543 (7644):252-256.

Thomas S.Kupper為臨床醫師、哈佛醫學院教授,在研究中發現memory T cells會因為Fabp (fatty acid binding protein)的缺陷,導致在個體內的存活時間明顯縮短;將正常與Fabp有缺陷的老鼠肢體末端處以皮膚感染,於五天後開始追蹤兩邊Memory T cells的比例。在前一個月,兩種老鼠的Memory T cells的比例都差不多,但之後Fabp缺陷的memory T cells則開始快速減少。

為了進一步確認此差異是由於脂肪酸代謝的缺陷所導致的,使用海馬生物能量儀進行實驗;正常的T cells在處理Palm-BSA時,耗氧會因為脂肪酸代謝而明顯提升,此時加入Eto抑制脂肪酸代謝便可見耗氧下降(左圖);而Fabp異常的T cells 即使加入Palm-BSA也無法提升耗氧(右圖),表示此細胞脂肪酸代謝能力是異常的,這便是此細胞於皮膚感染時存留在患部時間縮短的原因。

此研究證實了脂肪酸代謝對於memory T cells存留在個體內時間長短扮演了重要的因素;進一步衍伸,是否可藉由memory T cells脂肪酸代謝能力的提升來提高疫苗與臨床細胞治療的效果,都相當值得嘗試與研究。脂肪酸代謝可以提供細胞穩定且大量的能量供給,因此人體內最偏好脂肪酸代謝的細胞便是心肌細胞,其它還有許多偏好脂肪代謝的癌症細胞、能夠有效燃燒脂肪的棕色細胞與不確認脂肪代謝扮演角色的各式細胞,都等著您使用海馬生物能量儀來一探究竟!

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共同研究室研究新知&貴重儀器訓練課程 

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超微弱化學發光儀暨影像分析技術介紹(自由基測定儀)

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