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第九十二期 AUG.10.2021

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主編的話

為了瞭解腎臟組織及分生的病理變化,大、小鼠的腎病模式是我們很好的研究方式,其中一項最關鍵的腎病指標就是腎絲球濾過率 (glomerular filtration rate; GFR) 。在囓齒類,傳統測GFR的方法是複雜且不方便,若是再考慮到對動物的壓迫性及麻醉,以及抽血、驗尿等誤差,住往造成GFR測量上的不準確性,而誤判了早期腎臟的病變。最近,帶螢光的sinistrin-FITC可以從皮下被測到,讓測量GFR的工作又簡化很多,可以在清醒的mice身上外掛一小裝置,就可即時測出GFR。本期電子報就是介紹這一簡便的方法,相信會給讀者帶來一新的思維。下一期電子報主題為臨床級細胞分選及細胞製程收集設備平台介紹」,敬請期待並竭誠歡迎您訂閱共同研究室電子報收取儀器介紹、研究新知、與每月訓練課程資訊,更歡迎您與我們聯絡,給予我們建議與鼓勵。


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新型小動物腎功能監測系統之應用
 

錫昌科技股份有限公司生命科學部張家瑋先生

在臨床前腎臟疾病的研究,不乏會利用到大、小鼠動物疾病模式來進行研究分析,在大小鼠的腎功能評估方法中,主要分為外源性及內源性,兩種方法都各有其優點以及缺點。外源性的方法,主要利用外在物質注入動物體內,並用對應的方法去分析這些外源物質於體內的殘留量,進而評估腎臟的過濾功能。最理想的外源性物質,不乏希望有下面幾種特性:可以迅速分布在細胞外液、並且不會與血漿蛋白結合、可以被腎絲球過濾、不會被腎小管分泌或是再吸收、可以被腎臟完全排出體外、不易被降解、最後是大家都期望的,價格要低廉、容易取得而且容易測量[1]。

目前常見的外源性物質例如菊糖、放射性造影劑以及非放射性造影劑。內源性的方法主要是量測動物體內自然代謝產物,例如CreatinineBUNcystain Calbumin…等。

外源性物質給予的方法,可分為一次劑量清除以及固定劑量給予的血中清除兩種方式,實際作法是將菊糖類的外源性物質藉由靜脈注射打入動物體內,利用儀器量測菊糖在血液及尿液的含量,並利用公式演算得到腎絲球過濾率(GFR),不過因為動物可採血量或是採血方法等的限制,往往 無法得到很精確或是大量的數據點去描繪回歸曲線,加上目前常用的外源性的物質取得不易,亦或是具有放射性或毒性進而增加實驗的困難度。內源性物質雖然都是以生物體內的內分泌物質為主,但是在反應生理狀況的速度上,反而慢了許多,另外同樣也會有因為採血的問題,讓研究人員無法得到多點的實驗數據。

在以上種種不便狀況下,新的外源性分析方法於是被提出。MediBeacon,一間德國 的新創公司,於近年發表了最新的腎功能量測技術,「經皮穿透量測技術」。MediBeacon主要利用Sinistrin(類菊粉左旋糖),一種糖類聚合物,在其結構上掛上FITC螢光特性後注入動物體內,再將具有接收發光與紀錄功能的微型接受器,貼附在小鼠或大鼠於脊椎側旁的背上,由於這個區域接近動物的腹主動脈與下腔靜脈,當微型接受器的LED光源經過皮膚照射進入到血管後,會激發血管中FITC-Sinistrin產生螢光,利用螢光強度來評估Sinistrin於動物體內的殘留量,進而計算腎絲球的過濾能力。

相較於過去的外源性方法,經皮穿透量測法顯現不一樣且更簡便的特質,將大鼠或小鼠輕度麻醉後,將微型接收器貼在動物背上,記錄約5分鐘的基準線,再從動物的尾靜脈依照動物的體重施打定量的FITC-Sinistrin,並將動物放回獨立的鼠籠中記錄1~1.5小時,再將接收器取下,連結至電腦讀取數據並計算GFR值。藉由經皮穿透量測法,研究人員可以觀察到連續的FITC-Sinistrin體內含量的變化,並透過三分量模型進行數據回歸統計,可以得到更精準結果,而且可以減少 動物被抽血的次數,避免因為過多的操作影響到動物生理狀況及實驗數據準確性,且Sinistrin不具放射性,不會 有其他的副作用或是後續處理的問題[2]。

為了確認經皮穿透量測法的準確性,研究人員利用三組動物模式:健康的大鼠、單側腎臟摘除的大鼠以及誘發多囊性腎臟病的大鼠,分別利用酵素測定法(Enzymatic measuremnt)以及螢光測定法(Fluometric measurement),對經皮穿透量測法(Transcutaneous measurement)進行驗證,結果發現,不論是健康的大鼠或是疾病鼠模式,三種方法所測量出來的半衰期(t1/2)沒有顯著的差異,同時所評估出來的GFR值也幾乎相同,但是藉由經皮穿透法量測出來的數據其95%信賴區間相較於其他兩種方法更窄,意味著其方法的可靠性良好[3]

另一方面,研究人員也注意到此種方法在測量過程中,不會對動物產生生理上的不良反應,因此利用無線遙測系統對清醒大鼠進行平均血壓、心率以及活動力的監測,結果發現,輕度的isofluorane麻醉,雖然會讓動物的平均血壓下降,但是也因為是輕度麻醉,很快地在15分鐘左右平均血壓就恢復到正常狀況,在後續的量測過程中,不論是心率或是平均血壓也都沒有顯著的變化,活動力在整個量測的過程中也趨於穩定,表示利用經皮穿透法的量測過程,對動物不會產生過多的刺激,動物也可以在比較平穩的環境下進行量測[4]

在研究的文獻中,也有研究學者發現在某些動物模式下,經皮穿透量測法相較於一些內源性的分泌物有更好的敏感度(sensitivity),如在鹽敏感高血壓鼠(Dahl Salt-Sensitive Rat),在鹽分的誘導下會導致腎臟的過濾功能低下,研究人員餵食Dahl大鼠高鹽分的飼料,會誘發大鼠平均血壓上升,研究中發現,Creatinine雖然是研究中常用於評估腎臟功能的內源性物質,但是其敏感度遠不及經皮穿透量測,在動物模式中7天、14天以及21天的數值均沒有顯著的差異,而藉由經皮穿透量測的GFR值於第14天就有顯著的差異,表示利用該方法監測模式動物的腎臟功能,其敏感度與反應較creatinine還要優異[5]。

而目前經皮穿透量測已經有不少的應用文獻發表,例如在糖尿病與腎臟病的研究中,研究人員發現在db/db mice(第二型糖尿病模式鼠)的動物模式中,餵食高蛋白飼料會加速腎臟疾病的發展,其中利用的方法就是經皮穿透量測得到餵食高蛋白飼料後,db/db 小鼠有腎臟過度過濾的問題產生,而SGLT2抑制劑可以抑制其過度過濾的狀態[6]。

經皮穿透量測,對於臨床前的動物實驗可以說是方法上的一大突破,而腎功能的量測,不僅僅是對於腎臟疾病的研究或是相關藥物的開發有很大的幫助,在於心血管、代謝性疾病等研究中都十分有益處,藉由其簡單且對動物不會造成太多傷害與壓力的實驗方法,就得到精準且可靠的腎功能數據,相信在未來相關的研究上會給予更大的幫助。

1.Susan E., M., Adam K. Myers, Overview, Glomerular Filtration, and Renal Clearance Mulroney, in Netter's Essential Physiology, 1, Editor. 2009. p. 202-213.

2.Friedemann, J., et al., Improved kinetic model for the transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in experimental animals. Kidney Int, 2016. 90(6): p. 1377-1385.

3.Schock-Kusch, D., et al., Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney Int, 2011. 79(11): p. 1254-8.

4.Lucinda M. Hilliard, K.M.D., Transcutaneous assessment of glomerular filtration rate in unanesthetized rats using a small animal imager: impact on arterial pressure, heart rate, and activity. Physiological Report, 2016. 4(19) e12723.

5.Cowley, A.W., Jr., et al., Progression of glomerular filtration rate reduction determined in conscious Dahl salt-sensitive hypertensive rats. Hypertension, 2013. 62(1): p. 85-90.

6.Norgaard, S.A., et al., Nephropathy in diabetic db/db mice is accelerated by high protein diet and improved by the SGLT2 inhibitor dapagliflozin. Eur J Pharmacol, 2019. 860: p. 172537.

 

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