醫學研究部共同研究室

流式細胞儀(Fluorescence Activated Cell Sorting；FACS)已被廣泛應用於生物醫學研究分析，本期電子報介紹的流式細胞分析儀(Flow Cytometer)，是以雷射光激發由水柱包圍的細胞，經由光電轉換訊號至電腦，以方便使用者操作實驗並分析，且最新型的儀器已達到自動化分析的功能，目前醫學研究部已有五種不同機型共七台儀器供使用者依實驗需求進行選用。本期電子報的科學新知將介紹流式細胞儀在SP(side population)細胞上的分析應用與原理，期望能協助同仁獲得最佳的實驗結果。下一期電子報將會介紹用於觀察細胞行為的細胞行為儀及實驗中細胞耗氧情況的耗氧儀，目前於第八共同研究室提供此兩種儀器，有需要的同仁請密切注意下期的電子報喔！歡迎您訂閱共同研究室電子報以獲得相關訊息。同仁對於共同研究室如有其他新的研究服務需求，更歡迎您與我們聯絡，給我們建議與鼓勵。

為協助醫學校區學術研究，醫學研究部在2014年已設置了配備有三支雷射的cell sorter，並聘任專職技術師楊凱婷小姐 (ntuhsorter@ntuh.gov.tw)負責相關業務，現正實施暑期優惠活動：期間使用三個時段贈送一個時段，正熱切開放服務中，歡迎大家多加利用(預約規則請參閱醫研部網站)。

TOP

璀璨的科學年代--新一代的基因體分生技術與臨床應用講座

為讓全院同仁更了解新一代的基因體分生技術，如次世代定序 (NGS) ，數位PCR (digital PCR)的發展與臨床應用等，醫學研究部邀請相關單位舉辦一系列講座。8/20(三)將邀請萊富生命科技公司，來分享以下主題(報名請點我)：

九月初將邀請均泰生物科技分享NGS Illumina平台之發展與應用，敬請期待。另為使共同研究室提供之服務貼近同仁的實際需求，懇請協助填寫研究需求調查問卷，以促進共同研究室提供更高品質之服務。謝謝您!--填寫問卷表單--

流式細胞技術（flow cytometry）是指在流體狀態下觀測細胞的一種技術，而流式細胞儀（flow cytometer）則是指細胞於流體狀態下移動時，能夠觀測及記錄細胞特質的儀器。這種儀器主要包含三個部分：液流系統(fluid system)、光學系統(laser system)及電子系統(electronic system)。流式細胞儀之液流系統主要的目的是將散布於 3 度空間水柱中的細胞或顆粒，使其能一顆接著一顆地通過雷射光束。在液流水柱（fluid stream）中的細胞，被雷射光激發後所產生的光學訊號，經由一連串的透鏡（lens）及濾鏡（filter）後，可將光線依波長及散射角度引導到不同的偵測器，再經由光電倍增管(Photomultiplier; PMT)將類比訊號轉換為電子訊號，經電腦加以分析而可得知樣品中的細胞類型及特性。流式細胞儀產生並分析的訊號主要有散射光訊號和螢光訊號。散射光訊號的強弱可以反映細胞的大小、型態及顆粒性等。而螢光訊號則是當細胞本身帶有螢光物質（fluorochrome），或被帶有螢光物質的抗體、或其它螢光物質標定時，用不同波長的雷射激發，會發射出不同波長的螢光，可顯示不同的螢光訊號，在不同的實驗體系中，這些螢光訊號就可以反映不同的細胞生物學特性。

流式細胞儀目前已成為免疫、血液及腫瘤學研究不可或缺的利器，其運用及用途相當的廣泛，包括：測定淋巴球表面抗原，藉此將各種不同分化時期或不同功能的淋巴球予以分類；白血病分類，可協助鑑別惡性血液疾病，作為治療及預後的指標；最小殘留疾病之偵測(MRD)；骨髓移植；器官移植；腫瘤細胞的Total DNA Analysis；以及細胞凋亡現象(Apoptosis)；細胞氧化壓力；幹細胞side population的偵測等。

目前，共同研究室建置有五種不同機型之分析儀，相關配備與規格詳如表一。以下僅針對使用與應用較廣泛之機型進行介紹：

FACSCalibur

FACSCalibur是大多研究機構最常見的桌上型流式細胞儀，也是第一台無需調校光路，並整合雷射間補償和雙雷射技術的多色分析細胞儀。FACSCalibur系統具有氬離子雷射(488nm)和紅色二極體(635nm)，提供四種螢光分析，可廣泛地針對基礎細胞表面抗原研究、細胞週期及臨床上白血球族群、淋巴球等比例分析。若使用的螢光，其激發所發射的光譜會重疊，在操作設定，需要進行螢光補償（Compensation）。一般而言，上樣的試管以Falcon tube (5 ml)為主，需要人工操作。若是儀器選配有高通量微孔盤(96-well或384-well)，則可進行自動化快速分析。此機型的BD FACStation工作軟體，主要是建置在MacOS系統，用來收取實驗數據和分析結果，由BD CellQuest Pro軟體來執行，可獲取快速準確的結果，並圈選細胞群以進行運算任務與統計分析。

FACS LSR II

LSRⅡ是一台最多可配置四支雷射，可同時分析多達18種螢光參數的高階流式細胞儀。此種機型的設計為了滿足高階研究對多色分析的嚴苛偵測需求，其訊號收集系統被設計成八角形(Octagon)或三角形排列(Trigon)的光電管組成，這種設計可以有效地從每一個雷射中檢測光信號，八角形檢測器陣列包含七個光電管，負責檢測來自藍光的訊號，其中一個光電管負責檢測90度側方散射光訊號，三角形檢測器陣列包含二個光電管，負責檢測來自紅光的訊號。

目前第二共同研究室設有一台LSRⅡ，除了配置有基本的488nm藍光雷射外，還配置有一支較為少見的355nm UV雷射，除了應用在測定淋巴球表面抗原、白血病分類、細胞週期和細胞凋亡等實驗分析外，還可提供使用者針對幹細胞做side population的偵測 (side population的原理與應用請詳見本期電子報科學新知專欄)。

FACSVerse

FACSVerse為新一代智慧型的流式細胞儀。由於傳統流式細胞儀的儀器設定步驟較為繁瑣，學習門檻較高，初學者難以在短時間內上手並產出穩定且高品質的實驗數據，FACSVerse以標準化的儀器設定步驟，自動調節儀器電壓與螢光補償值，不但可以大幅降低學習門檻，也可以確保實驗數據的可信度與重複性。目前第三和第八共同研究室皆購置有這台機器，配有488 nm和640 nm兩支雷射，可支援多達六色的螢光偵測分析，讓研究人員的實驗更加廣泛。

此機型除了具有自動補償校正（autocompensation）的功能外，還附有自動上樣器（Autosampler）：盤式與管式均可，提供樣本數過多之研究人員進行分析。此外，上樣管可使用傳統之Falcon tube（5 cm、15 ml、50 ml）外，若因檢體量過少，還可使用Eppendorf tube 進行上樣。為使初學者方便上機，此儀器還具有內建分析protocol，讓使用者可快速獲得具可信度的數據。

圖一、醫學研究部配置之常用流式細胞分析儀

使用說明

目前「FACSCalibur流式細胞分析儀」於第三及第七共同研究室各有一台；「FACS LSRII流式細胞分析儀」放置於第二共同研究室；「FACSVerse流式細胞分析儀」於第三及第八共同研究室各配置一台，歡迎同仁預約使用。儀器預約或諮詢請洽:第二共同研究室管理人員劉貞小姐，分機：65760，電子信箱cliu001@ntuh.gov.tw；第三共同研究管理人員歐陽璞小姐，分機：65725，電子信箱uno5725@ntuh.gov.tw；第七共同研究室管理人員袁惠萍小姐，分機：63162，電子信箱hpyuan@ntuh.gov.tw；第八共同研究室管理人員洪煜堃小姐，分機：63480，電子信箱hungyk@ntuh.gov.tw。

FACSVerse及FACS LSRⅡ流式細胞分析儀有提供委托操作服務，費用為250元/小時，詳情請洽流式細胞實驗室楊凱婷小姐，分機：65831；第三共同研究室蔡靜儀小姐，分機：65725。

表一、醫學研究部各類型流式細胞儀比較表
　

共研別廠牌/型號 Laser Emission Filter（nm） Autosampler Software
費用*
聯絡人

二共 BD LSR II
488nm

(4色)

530 / 30

575 / 26

695 / 40
    780 / 60 No
FACSDiva

FlowJo
(離線分析)
　
25元/15分鐘
劉貞
#65760
　

355 nm

(2色)

　

Side population analysis:

670 / 14
    450 / 50

Multicolor analysis:

530 / 30
    450 / 50

　
Spare filters（依使用者需要由管理人員進行抽換與設定）：

405 / 20

585 / 42
    610 / 20

三共 BD FACSVerse
488 nm

(4色)

488 / 15

527 / 32

586 / 42

700 / 54

783 / 56

660 / 10
Yes FACSuite 100元/時歐陽璞#65725

640 nm
(2色)
783 / 56

四共 BC Epics XL-MCL
488 nm
(4色)
525

575

620
675 Yes EXPO32 ADC 無
buffer自備張瑞宗#66680

七共 BD FACSCalibur
488、635 nm
(3+1色)
530 / 30

585 / 42

670 LP
661 / 16 No Cell Quest Pro 100元/時袁惠萍#63162

八共
BD FACScan
488 nm
(3色)
530 / 30

585 / 42
> 670 nm No Cell Quest 無
buffer自備洪煜堃#63480

BD FACSVerse
488 nm
(4色)
488 / 15

527 / 32

586 / 42

700 / 54

783 / 56
660 / 10 Yes FACSuite 100元/時

640 nm
(2色) 783 / 56

九共 BD FACSCalibur
488 nm
(3色)
530 / 30

585 / 42
> 650 nm No Cell Quest 無
buffer自備李昇憲#67834

*自行操作費用依目前FACSFlow廠商售價與各機台實際使用情形計算，每次付費為一桶之整數倍。
　

TOP 　

科學新知

利用流式細胞儀偵測Side population幹細胞的原理與應用

醫學研究部楊凱婷技術師

近年來利用流式細胞儀偵測side population(SP)已成為幹細胞研究的重要分析方法。這個方法最早是在1996年，Goodell研究團隊發現當利用Hoechst 33342 做為vital dye染上mouse bone marrow cells後，在flow cytometry點狀分析圖中，有一小群細胞在450nm (Hoechst Blue) 及675nm (Hoechst Red)這兩種螢光的螢光表現量偏低，此小群細胞即被稱為「side population(SP)」。研究者進一步分析side population的細胞，發現這些細胞大多都有造血幹細胞(Hematopoietic Stem Cells, HSC)的分子標誌特性(Lin^-Sca-1⁺)表現，將其分離出來做功能性分析，發現這群SP細胞也同樣具有幹細胞之功能特性(可自我更新且有再生所有不同型血球細胞的能力)。而後研究人員也證實，因幹細胞內MDR1、ABCG2等ABC運輸蛋白(ATP-binding cassette transporter)的表現量遠高於一般細胞，故容易將攝入的疏水性螢光染劑排出，而使其在Hoechst dye染色後螢光值偏低，即為SP的族群位置(如圖二)。

這個SP的偵測分析方法提供了許多研究者更有效率地探討其他adult stem cell族群的可能性。經過了十多年的研究發展，SP assay已成為普遍辨析stem cell的方法之一，且可應用在不同的組織中，包括臍帶血、骨骼肌肉、腎臟、肝臟、乳腺、肺臟及前腦。另外近年來也有越來越多的研究團隊透過SP分析技術來研究cancer stem-like cells，且透過瞭解SP phenotype也可能可以解釋cancer cell中對於化療藥物抗藥性的次族群的存在。研究也發現Primary mesenchymal tumor中SP族群的存在比例和腫瘤等級有相關性，未來有可能當做治療癌症病人癒後結果的分析指標。SP族群分析的研究方法是個可被廣泛應用且於stem cell相關研究領域中具有高度發展潛力的實驗技術。

利用流式細胞儀偵測SP的技術，雖然目前已開發出可利用405nm violet laser來激發的dye取代Hoechst 33342染色，但傳統上還是以Hoechst 33342配合355 nm UV laser所呈現出來的數據較為廣泛被接受。配置有355 nm UV laser的流式細胞儀並不常見，而目前臺大醫學校區僅第二共同研究室設有一台配置UV雷射的高階流式細胞儀(LSRⅡ)，可供SP相關研究分析的應用，並提供相關的委託操作服務，歡迎有需求者前來預約使用。

圖二、小鼠骨髓細胞染上Hoechst 33342螢光之點狀分析圖。(A)小鼠骨髓細胞染上Hoechst dye後，圈選處指出SP區域，僅佔全部骨髓細胞中的0.1%。(B)具有Sca-1⁺及lineage marker^-/dim的細胞多座落於A圖所指出的SP區域，百分比約為75-90%。(C) 在小鼠骨髓細胞中Sca-1⁺及lineage marker^-/dim的細胞族群，其圈選的區域與B圖是相同的。(D) C圖所圈選的細胞族群，有多數會坐落於A圖SP的區域。(此圖引用自Journal of Experimental Medicine , Vol. 183, 1797–1806,1996, Figure 1)

TOP 　

共同研究室貴重儀器訓練暨研究新知課程　

儀器訓練課程:課程網路報名

	8月05日	石蠟切片機之原理與實機操作
	8月14日	同步定量PCR之原理與應用(ABI 7900HT Real-time PCR)
	8月15日	快速轉漬器之儀器訓練課程(Turbo Blotting System)
	8月19日	內毒素偵測適用範圍之訓練課程
	8月20日	冷光影像分析儀之應用與實機操作示範(GE LAS4000)

研究新知課程:課程網路報名　

	8月06日	近紅外光螢光偵測 Cell-based 蛋白表現技術新知
	8月20日	璀璨的科學年代--新一代的基因體分生技術與臨床應用新知講座

歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器訓練與研究新知課程講習相關資訊。

TOP

為持續提供優質之研究服務，便於日後聘用專職技術人員、購置新儀器、現有儀器汰舊換新與維護保養等等，敬請於使用共同研究室資源並發表論文時，於論文致謝（Acknowledgement）處加入致謝共同研究室之文句，並於論文發表時通知共同研究室管理人員。致謝文句請依實際使用情形書寫，或請參考以下範例：We thank the staff of the Core Labs, Department of Medical Research, National Taiwan University Hospital for technical support.
　