啓弘生物科技股份有限公司 郭倉志博士/陳俐穎博士

基因治療的發展歷程

基因治療是指利用分子生物學方法將特定的遺傳物質導入病患體內，使之達成目的基因產物，從而使疾病得到治療，為現代醫學和分子生物學相結合而誕生的新技術。

1960年Rogers以及Pfuderer證明病毒可以調控基因移轉，進而有了基因治療的概念，1960年代後期，便逐漸發展出一些特定功能的細胞株，其目的為測試外來DNA是否能永久且穩定的表現並遺傳給子代。歷經30年的研究後，人類史上第一次的基因療法於1990年9月首度問世，試驗者為患有遺傳性疾病腺苷脫氨酶(Adenosine Deaminase，ADA)缺乏症的四歲女童。由於患者對細菌、病毒以及真菌皆缺乏免疫力，因此嚴重時可能危害到生命。醫院從患者體內取出白血球，並將能夠製造ADA的基因轉殖入白血球中，再將這些被基因校正過的白血球注射回患者體內，為基因療法歷史上的重要里程碑。

然而，基因療法發展過程中，出現了臨床試驗上的死亡案例，隨著負面效應逐漸擴展，基因療法甚至受到相關領域專家學者的輕視。儘管歐洲監管機構於2012年批准部分這類型的療法，仍因患者在治療後引發嚴重的胰臟炎病症，使得基因療法的效果與安全性備受質疑，相關研究及試驗的腳步也暫時緩下來。

直到近年，基因治療在一系列疾病的臨床試驗中表現不俗，包含血友病、鐮刀型紅血球疾病等，逐漸展現出其應用價值及發展的可能性，使得投資者因此回流，而美國食品藥品管理局(FDA)近年批准的基因療法，無疑是對這領域的鼓勵與肯定。

巨幅成長的市場規模

2012年，歐盟首度批准第一個基因治療藥物Glybera後，全球每年批准的基因治療臨床試驗已超越過往20年間的最大值，FDA也於2019年1月宣布，預計在2025年前每年批准10到20項細胞及基因治療產品，意味著基因治療展現出其無限的發展性與未來性，導致市場需求量增加。除市場需求之外，在定價方面，基因治療藥物也要價不斐，以Glybera為例，在2014年正式上市時還是當時最貴的藥物(111萬歐元) ，如此高額的定價，是因為需要從有限的患者收回藥物的研發成本，這種高收益的特殊性質，使得投資者抑或是生醫藥廠願意挹注資金及資源進入基因治療領域。

目前基因治療使用的載體包含腺相關病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）、慢病毒(Lenti Virus, LV)、反轉錄病毒(Retro Virus, RV)等。2018年全球基因治療市場規模約為 5.4 億美元，由於嵌合抗原受體 T細胞療法(Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy, CAR-T)的臨床試驗結果近年屢傳佳報，激勵許多生物製藥開發商及學術研究團體搶進。根據Roots Analysis 2019年8月發表的研究報告，2030年CAR-T 療法的市場規模預計將有望達到110億美元，2019-2030年的年複合成長率上看 31%。基因、細胞治療市場正以倍數蓬勃發展，市場規模預計於2027 年成長至356.7億美元，是2019年的10倍以上。意味著細胞及基因治療市場正處於急速發展階段。

近年業界的併購案，可窺視出藥廠對於細胞及基因治療的市場布局動作，像是Novartis以87億美元併購基因治療公司AveXis、Celgene以90億美元價格買下CAR T-cell公司Juno Therapeutics、Bayer以4億美元收購AskBio等，這些併購案的進行，意味著各大公司對於細胞及基因治療領域的重視，顯示出細胞及基因治療市場正處於急速發展的起飛階段。

基因治療的兩大方式

基因治療分成兩種方式：體外基因治療法(Ex vivo)以及體內基因治療法(In vivo)。體外基因治療(亦可視為細胞治療)是取出患者特定的細胞(如：嵌合抗原受體 T細胞，造血幹細胞等)至體外進行基因工程改良基因缺陷後，再選出機能表現正常且符合需求的細胞，移植回患者體內。

體內基因治療則是利用事先已經過基因工程改造後的基因，直接注射至患者體內進行治療。體內基因治療又可分為非基因體編輯和基因體編輯兩大類，非基因體編輯利用合成的DNA或RNA(如：RNAi，microRNA等)調節基因功能；基因體編輯則是利用基因工程的方式，插入、移除或取代有缺陷的基因。而在體內基因治療的基因遞送方面可分類成病毒載體(RV、AAV、LV等)及非病毒載體(Liposome、Nanoparticles等)兩種方式。

嵌合抗原受體 T細胞療法(Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy, CAR-T)

嵌合抗原受體 T細胞療法是先從患者的血液中分離出T細胞，接著利用基因工程技術製造出CAR混合基因(目前做法是以LV或 RV送入)，再將CAR基因轉殖到T細胞內，形成嵌合抗原受體 T細胞(CAR-T cell)。將CAR-T細胞在體外增生至足夠的細胞數之後，注射到病人身上，這些CAR-T細胞便可以與癌細胞結合，並消滅癌細胞。

獲得批准的基因治療藥物

Glybera (AAV1)：第一個基因治療藥物，Glybera是由UniQure公司所研發，應用於脂蛋白脂酶缺乏(Lipoprotein Lipase Deficiency)的基因治療藥物。將功能性LPLD基因包裹進AAV，通過一次性的治療，達到長期的顯著降低急性胰腺炎的發病率。

Strimvelis (cells & RV)： Strimvelis的治療原理與CAR-T類似。重症聯合免疫缺陷由腺苷脫氨酶突變導致的T淋巴細胞發育異常導致。在Strimvelis治療過程中，患者的造血幹細胞(CD34⁺)被分離出來，在體外進行基因修飾，導入了正常的腺苷脫氨酶基因(ADA)。這些經處理的造血幹細胞被重新送回至患者體內，產生正常的T細胞，進而重建患者的免疫系統。

Kymriah (cells & LV)：醫療史上第一款CAR-T產品，主要用於治療3歲-25歲的急性淋巴細胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)的復發性或難治性患者。ALL是一種起源於B系或T系淋巴祖細胞的腫瘤性疾病，也是最常見的兒童癌症。如果多次復發或者出現難治性B細胞ALL，則患者五年生存率低於10％－30％。

Yescarta (cells & RV)：2017年10月，吉利德收購Kite的Yescarta也獲批上市。用於治療至少接受過2種其他治療方案後無緩解或復發的特定類型大B細胞淋巴瘤(DLBCL)成人患者。它是首款針對特定非霍奇金淋巴瘤的CAR-T療法，也是史上第二款CAR-T療法。

Luxturna (AAV2)：用於治療RPE65突變引起的遺傳性失明。Luxturna的治療方式為利用病毒載體(AAV2)將正常的RPE65基因轉入視網膜細胞中以治療疾病。眼科基因治療藥物有著獨特的工業化優勢，眼部的目標細胞數量少，範圍也比較小，並不需要對病毒進行大規模的生產，可能只要中規模的生產就足以滿足眼科用藥的需求。

Zolgensma (AAV9)：用於治療兩歲以下脊髓性肌萎縮症(Spinal Muscular Atrophy, SMA)小兒患者。Zolgensma利用AAV9將健康的人類運動神經元存活基因(Survival Of Motor Neuron, SMN)遞送至患者體內，從而改善運動神經元功能和生存。由於患者無法生成SMN蛋白，故罹患此病的嬰兒將失去獨立進食和呼吸的能力。每10個患病的嬰兒，約9個會在兩歲之前去世，或者需要長期的呼吸機支持。Zolgensma無論在價格上或是療效上都成功取代了首個脊肌萎縮症治療藥物-Spinraza。

FDA六項指引及一項草案

為了促進基因治療產品發展的同時，一併確保其安全性與有效性，FDA於2020年1月28日公布六項最新的細胞與基因治療指引以及一項「根據美國孤兒藥法規解釋基因治療產品之相同性」 (Interpreting Sameness of Gene Therapy Products under the Orphan Drug Regulations ) 草案。該指引及草案提供研發人員與製造業者重要資訊包含了臨床新藥需如何符合相關規定，並公開揭露產品之安全、特性、品質、純度與強度。然而，在六項指引中有三項是為特定疾病基因治療產品之生產指引，例如成人與兒童之血友病、視網膜疾病，以及其他罕見疾病之療法重點，包含廠商須如實提供產品之生產、臨床前期、臨床試驗、臨床試驗設計等重要研究數據與資料。

GMP等級病毒載體生產   

病毒載體無論在細胞治療或是基因治療上都至關重要，因此如何大量生產臨床試驗用量甚至是商業GMP等級規模的病毒載體，無疑是門高深的學問。不論最終是否會成功商業化，臨床試驗之生物製劑(或藥品)其生產、製造與管制，phase I、phase II都需符合GMP之精神，phase III應符合「西藥藥品優良製造規範」 ( PIC/S：Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products)之要求。

病毒載體製備流程為一開始將複數個質體(plasmid)共轉染(co-transfection)到宿主細胞(host cell)，依據病毒載體的差異，所需的質體數量也不盡相同，收集中間產物再經由純化手續，去除不純物，進而得到高純度之病毒載體。病毒載體的製造需仰賴複數質體共轉染至宿主細胞，在宿主細胞部分可區分為貼附性以及懸浮性兩大系統，在病毒生產上游階段依據小量生產與大量生產的需求，而有各自匹配的儀器耗材。由於貼附性與懸浮性系統差異過大，大型工業化生產需要重新摸索所有的條件，如：細胞培養、轉染等。經過轉染步驟，其中間產物含有大量病毒載體外的不純物質，為增強後續的轉導效率，如何移除目標以外的不純物質，也是業界不斷精進的目標。在下游純化的策略以AAV為例可分成兩種方式：一、經由梯度超高速離心步驟，移除不純物，進而獲得較高純度的AAV。二、藉由兩道管柱純化步驟，同樣可以得到較高純度的AAV (Full AAV)。

病毒載體的製造過程中(質體、宿主細胞、中間產物至最終產物)，會進行適當的品質管制，如細胞庫及質體檢驗、產品安全性檢驗等，以確保整個製造過程及最終產物的品質合乎GMP規範。檢驗項目亦隨著檢體來源而有所變異，如宿主細胞的檢驗項目包含無菌測試等；批次放行檢驗則涵蓋較多檢驗項目如純度、品質、安定性等。

在病毒載體的品質方面，因偵測方法、偵測目標序列、宿主細胞株或製程添加物之差異，而造成病毒力價(Viral Vector Titer)或(Transduction Unit)數據略有高低，因此，於製程中，除需確保製造過程的一致性外，也需統一檢驗的偵測方法。針對單一檢驗項目的檢測方式有許多種，如在AAV的純度方面，穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy, TEM)等，為目前常用的檢測手法，可從外觀上區分出Empty AAV以及Full AAV。

綜合前述，病毒載體之製備從開發、臨床試驗用量乃至商業規模，依序進程為：測試階段→小量研發→大量研發→GMP先導測試→GMP製程。在各階段相對應的檢驗方法，應同時開發並進行確效，確保病毒載體可應用於臨床試驗甚至商品化。

由於基因及細胞治療產品的開發步驟，非常繁瑣費時，為了進一步提高研發效率，降低成本以及研發風險，許多製藥公司所採取的策略為：公司進行前期研發，委外CDMO (Contract Development & Manufacturing Organization)公司生產臨床試驗用量或是商業規模的病毒載體。且臨床試驗及商用規模之產品皆需符合GMP精神與規範，CDMO公司可以協助製藥公司節省漫長的廠房建設時間，使產品以最快的速度推向市場，搶占市場先機。優質的CDMO對於整個基因及細胞治療產品，從前端研發到臨床前期產品生產均可介入，包括：生產細胞建立、細胞庫及質體檢驗、病毒載體檢驗方法開發、病毒載體生產、產品安全性檢驗、批次放行檢驗、臨床(前)毒理試驗、臨床檢體檢驗等，提供一條龍式的服務，減少樣品運送及委外所耗費的時間成本，藉以因應急速成長的基因及細胞治療市場。　

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