台灣大學生命科學院科技共同空間 陳香君老師

1931年諾貝爾獎得主Ruska 與他的同事 Knoll將電磁透鏡的構想應用於實驗儀器上，他們在實驗室建造出第一部穿透式電子顯微鏡 (Transmission Electron Microscope, TEM)，電子顯微鏡以波長小於可見光的高能電子作為光源，使得影像解析度大大的提升，將在顯微鏡下的微觀世界更進一步的放大。1937年Metropolitan Vickers 公司生產了第一部商用穿透式電子顯微鏡原型，翌年(1938) von Ardenne在研究室製造了第一部掃瞄式電子顯微鏡 (Scanning Electron Microscope, SEM)。1938年德國Simens公司賣出第一部TEM後，一直到1958年英國的 Cambridge公司才推出商品化的SEM “StereoScan I”，並且應用於生物醫學領域的研究工作。1960年研究人員將高速電子打擊樣品後所發射出來的X-ray收集應用於樣品組成的元素分析。由於早期生產的SEM於影像處理及訊號處理技術未臻完善，影像解析不盡理想，直到1965年以後SEM才普遍獲得研究人員的青睞。1985~ 1990年間更結合電腦運用於電子顯微鏡的控制與操作 (Bozzola & Russell, 1999)。此後SEM發展更快速，機台性能大幅提高，且進行樣品材料分析的附加裝置越來越多，可應用的研究領域包含: 化學、物理、材料科學、地質、礦物、生物醫學等。還有環境掃描式電子顯微鏡（Environmental SEM, ESEM），能控制樣品室的真空度從高度真空降到接近大氣壓，所以是能夠在極低氣壓環境下運作的SEM。在具有濕度環境下，對於不便進行乾燥、導電等前處理之含水量較高的濕樣品，可用ESEM mode直接觀察，在應用上極為廣泛 (Morgan, 2005)。

本文將以掃瞄式電子顯微鏡 (後續皆以SEM表示) 於生物醫學領域的應用為主題進行介紹。SEM主要是應用於觀察樣品的表面形態，在生物樣本的製備過程相較於TEM的樣本製備簡單。因為生物樣本在進入TEM機台之前，常需要進行固定 (fixation)、滲膠 (infiltration)、包埋 (embedding)及超薄切片 (ultramicrotomy)。而SEM對於樣本表面解析度也可達到奈米尺度，SEM有較深的景深，因而對於物體表面三度空間細微結構的研究觀察，可以提供真實且方便的研判。SEM 是利用電子鎗 (electron gun)中的燈絲 (filament)透過熱游離 (thermo emission)或是場發射 (field emission)原理產生高能電子束，在通過電磁透鏡組後，將電子束聚焦至待測樣本上，利用樣本上方的掃瞄線圈偏折電子束，在樣本表面上進行XY軸的掃瞄。當入射電子束 (incident electron beam, primary electron)打擊樣本時產生交互作用，因而產生各種不同的訊號，如二次電子 (secondary electron)、背向散射電子 (backscattered electron)、陰極螢光 (cathodoluminescence)、歐傑電子 (Auger electron)、特性X光 (characteristic x-rays)⋯等。在SEM機台加裝能量分散光譜儀 (Energy Dispersive Spectroscopy, EDS)，可偵測樣本所產生的特性X光，即可針對樣品進行組成元素的定性及相對定量分析、元素分佈等分析。

目前台大生命科學院科技共同空間所設置的FEI Inspect S

圖1. FEI Inspect S (生命科學院科技共同空間生物影像平台).

生命科學院科技共同空間所配置的SEM為圖1中的機台，用以觀察樣品的表面，或是經過斷裂的樣本裂口可以得到清晰的影像。生物樣本放大10,000至 30,000倍，解析度可達1奈米。但是用來觀察含水量較高的生物樣品時，在真空環境下觀察水分容易被抽乾，導致細胞萎縮變形，因而無法對各種不同型態的細胞進行分辨，所以對樣品進入機台前的製備仍有一定要求。因為細胞或組織中的水分經由電子束照射後，高溫導致水分蒸發，而水蒸氣會加速電子槍陰極材料的揮發，從而降低燈絲壽命；水蒸氣會將電子束散射，增加電子束能量分散，增大色差，降低分辨能力。且因為生物細胞主要成分皆為碳、氫、氧、氮，導電性差，能產生的二次電子量也少，所以會在樣本表面鍍上金屬薄膜，以增加導電性。

有些生物樣本含水量低且不易變形的，可以不經過固定或乾燥，以較低加速電壓進行觀察，例如: 植物種子、花粉、昆蟲、毛髮等，但電壓低時，相對的電子訊號量少，影像品質差，進行觀察需要盡可能的縮短時間並且迅速擷取影像 (圖2 A& B)。

圖2A 白線雌蚊前足                                   圖2B 一串紅花粉

對大多數含水量高的生物樣本，建議採用化學或物理方法進行固定、脫水和臨界點乾燥，然後鍍金或碳膜提高材料的導電性和二次電子數量。應用傳統的化學方法進行樣品製備的過程包括：清洗、化學藥品固定、臨界點乾燥、鍍金或鍍碳。

1. 清洗：生物樣本取材時常會參雜異物且覆蓋標的部位，因此在進行化學固定之前，需要以生理食鹽水或等滲透壓的緩衝液等盡可能把表面覆蓋物清洗乾淨。

2. 固定：常採用醛類(戊二醛和多聚甲醛，或兩者混合之Karnovsky’s 固定液)與四氧化鋨雙固定，或是僅以四氧化鋨 (OsO₄)進行固定。四氧化鋨為重金屬固定液，不僅可保存組織細胞結構，也能增加樣本導電性和二次電子數量，提高SEM影像品質。

3. 乾燥：樣本經由化學固定後，通常會採用臨界點乾燥法以避免在乾 燥過程中因為水的表面張力所造成的樣品萎縮變形。通常會使用乙醇或丙酮溶液進行脫水，然後置入臨界點乾燥機 (圖3)中用液態二氧化碳等置換脫水溶液，達到乾燥的目的。

4. 鍍金：將乾燥後的樣品用雙面膠或導電性好的碳膠抑或是黏合劑黏 在鋁臺，再置於離子噴濺鍍膜機 (圖4)中噴鍍一層金屬膜，提高樣品導電性和二次電子產量，以得到最佳影像品質，並能防止樣品受熱和輻射損傷。

圖3 臨界點乾燥機                                圖4 離子噴濺鍍膜機

圖5 A&B. SEM micrographs reveal that mouse corneal endothelium is a single  layer of corneal endothelial cells with a regular hexagonal shape (yellow arrowhead). In addition, the microvilli appeared as pro-trusions on the cellular surface (red arrowhead). (組織工程與再生實驗室 吳岳峰博士提供)

圖5 即是應用化學方法進行樣品製備後所擷取的影像。

上個世紀80年代低溫掃描電子顯微裝置被迅速發展和廣泛應用，包括生物樣品的冷凍固定、冷凍乾燥、冷凍斷裂等技術。

1. 冷凍固定：將生物材料投入低溫的致冷劑中，如:液氦、液氮、及丙 烷等，經由急速冷凍使細胞或組織結構和化學組成接近於活體狀態。被冷凍固定的生物樣本，可在低溫條件下轉移到具有低溫樣品臺的掃描電子顯微鏡中直接觀察，或在冷凍樣品表面噴鍍薄層金膜，這個方法快速簡便，而且可以排除由於乾燥法造成收縮的假象，適合含水量很高的材料。

2. 冷凍乾燥：將樣品經冷凍固定後，將所含水分凍結成冰，表面張力消失；再將冷凍樣品置於真空中，使冰漸漸升華為水蒸氣，樣品在一定程度上避免了表面張力造成的形變。

    圖6A 青黴菌                                 圖6B 醉月湖中藻類

圖6 皆為含水量高的樣品應用急速冷凍進行樣品製備後所擷取的影像(Tang, et al., 2011)，傳統的化學固定法常會造成這些水分含量高的樣品萎縮形變。

以生物領域而言，SEM可觀察的標本厚度大，可測定的訊息多，若能配合能量光譜儀(EDS)以X光能量來分辨偵測樣品中的元素，應用於分析相當厚度的生物試樣內元素的相對濃度，進行定量的工作，對於試樣定性與定位的分析實為一相當有效且快速的工具，如應用於研究生物發育過程中相關元素的分佈與變化或是重金屬污染的生物材料均是極佳的分析儀器。對於本校生物醫學領域，以生物材料為研究主題的研究室實可提高其研究之效率。

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