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隨著醫療個人化趨勢發燒，癌症腫瘤研究也逐漸趨於探究各單細胞間異質性，藉以尋找出不同過往的細胞訊息傳遞路徑及細胞標記蛋白(biomarker)。

細胞異質性(heterogeneity)的研究，主要可區分為腫瘤細胞異質性(腫瘤抗藥基礎和腫瘤惡性標誌)、幹細胞異質性(幹細胞分化發育基礎)、免疫細胞異質性(免疫反應狀態)等。現行研究單細胞工具如單細胞定序、流式細胞技術為主流。然而因基因的表現水平並不等同蛋白的表現水平、受制於流式細胞技術上的侷限、胞內蛋白檢測的困難及在傳統western blot上所偵測到的訊號為一群細胞蛋白表現量的平均值，對於探究細胞間異質性仍稍有不足之處。

Protein Simple公司研發的Milo系統因此應運而生，Milo原理主要建構在傳統western blot基礎上，在同次上機中可測量數千個單細胞中的蛋白質表達量，因此可以分析樣品中各細胞間異質性。

實驗僅需待測細胞懸浮液，利用scWest晶片捕獲約1,000個單細胞，接著，透過Milo將晶片上的每個單細胞裂解物上進行1分鐘的快速SDS-PAGE分離。最後，只需使用各種常規Western blot抗體即可測量每顆單細胞上至多約12種蛋白質。與任何其他單細胞技術相比，使用Milo的single cell western blot可以解鎖單細胞蛋白質表現狀況並測量更多不同蛋白質組；且在分離固定後之蛋白晶片在適當之保存可長達9個月，因此可達到同一樣本在不同時間下進行多次蛋白偵測，使得研究者在珍貴樣本上得到更多的研究訊息。

 
　[Milo 系統運行操作流程]　

 Milo的single cell western blot偵測結果與單細胞基因定序RNA-Seq定序分析結果結合，可用於同步分析細胞內基因水平狀況及後續下游蛋白質表現情況，藉以分析細胞內各基因相互調控情況，相關運用研究如下說明:

 
　

相關研究案例:

1.追蹤幹細胞分化訊號異質性

HMGCS2蛋白為粒腺體合成酶(HMG-CoA synthase 2)，主要參與催化生酮作用(ketogenesis)的第一步反應中。文章作者利用Milo單細胞western blot透過追蹤HMGCS2表達量訊號，在已分化的哺乳動物小腸細胞中，分離出能夠進行自我修復的Lgr5+幹細胞(ISCs)。同時，發現當Lgr5+幹細胞有HMGCS缺失現象時，產生β-OHB訊息傳遞受阻現象，此會促使Lgr5+幹細胞的分化偏向分泌性細胞狀態，並會受到外源性β-OHB (exogenous β-OHB)和I類組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）抑制劑作用調節。此調節作用為在幹細胞自我分化及損傷中重要作用機制。(參考文獻: Chia-Wei Cheng et al. Cell, 2019)

2.驗證乳腺癌細胞異質性

Single cell western blot可用於驗證癌細胞異質性。加州大學歐文分校（University of California, Irvine）的研究團隊，利用Milo的single cell western blot偵測來自7個不同罹患乳腺增生病患的細胞檢體樣本，驗證由單細胞mRNA測序(ScRNAseq)檢測25,790個乳腺上皮細胞的轉錄組(transcript)結果，闡述乳腺上皮細胞在逐漸轉化乳癌細胞中基因與蛋白表現量之間相互作用關係。

以突變基因KRT8為例，文章作者將ScRNAseq結果利用無偏聚(non-polar)統計分析法下發現了三種不同的上皮細胞群的存在。一種是基底細胞，另一種是具有兩型的導管腔上皮細胞，分為激素分泌型L1細胞和激素反應型L2細胞。進一步依據KRT8的蛋白質表達量將細胞分為三個亞群:未表現(陰性)、低表達量及高表達量並計算癌細胞轉化過程中各時期下各亞群細胞的百分比(即數量)。文章作者發現轉化過程中，KRT8的蛋白質表達量在L2型細胞中比L1性表達水平高，說明在不同轉化時期下，即使基因的RNA表達水平相近，後續下游蛋白表達水平仍有所不同。 (參考文獻: Nguyen, et al. Nature Communications, 2018)

3.循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells)之標記蛋白(Biomarker)異質性分析

文章作者從乳腺癌患者的血液中分離出循環腫瘤細胞(CTC)，利用Milo單細胞western blot分析12種標記蛋白的異質性，包括已被用於癌症分型(ER、HER2、EGFR)、循環腫瘤細胞鑑定(EpCAM、panCK、CK8)、白血球細胞標記(CD45)的蛋白和普遍表達於哺乳動物細胞的蛋白(GAPDH、β-tubulin、mTOR、ERK-1/2、eIF4E)。文章作者希冀透過擴大標記蛋白名單，終能更精確地針對癌細胞進行分類，藉以針對不同癌細胞選擇最適合標靶治療藥物。(參考文獻: Sinkala, et al. Nature Communications, 2017)

 　

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