金萬林企業股份有限公司 崔瑞廷經理

在生醫研究領域，顯微技術一直是不可或缺的重要工具，而現今研究不僅講求顯微影像解析度，更進一步要求能夠量化、具統計意義以及具再現性。ImageXpress系統因此應運而生，提供自動化高品質顯微影像擷取以及量化的研究利器。此系統可自動化拍攝玻片以及6-1536孔盤，拍攝全程使用雷射自動對焦與磁懸浮式載物台進行高精度影像擷取，並可對影像進行各樣定量分析，如: 蛋白質定量、細胞移動軌跡追蹤、apoptosis、co-localization、mitochondria分析……等。本期電子報將以ImageXpress NANO機型為例，列舉實際應用如下：

應用範例：

1.細胞無標記藥物毒性檢測及分析

通過穿透光/相位差影像的方式，檢測細胞增殖、毒性、Clone形成，並可在無標記、完整細胞狀態下提供多參數、即時的資料。

圖1：不須螢光標定的細胞相位差影像及定量分析。右圖以穿透光拍攝之細胞影像；左圖以軟體定義「細胞」及「非細胞」大小後，即可自動計數細胞（綠色）。

2.神經毒性分析

包含神經退化性疾病、神經分化實驗等在內，神經細胞、組織的觀察一直是最主要的實驗之一，而所有藥物在開發中一定需要進行毒性/安全性測試，神經毒性評估即為其中之一。ImageXpress NANO可進行神經細胞拍攝與定量，如圖2所示，神經細胞（iCell® Neurons（Cellular Dynamics International））培養於poly-d-lysine coated 384孔盤（7,500 cell/well）中48小時，再加入藥物測試72小時，最終用4% paraformaldehyde固定，再進行細胞核（如: Hoechst）與神經軸（如: β-tubulin III）螢光標定，即可使用軟體內建Neurite tracing/ outgrowth模組進行神經生長/毒性分析。分析參數包含cell number、outgrowth、branch、process、neuron area……等。圖2中可清楚看到進行Methyl mercury作用後神經軸斷裂/萎縮的情況，亦可進行量化分析（圖3），在一盤的實驗即可完成數十種藥物的多濃度、duplicate測試。相較於傳統顯微鏡使用玻片與人工為主的實驗方法，高內涵螢光顯微系統可提高實驗效率並能進行後續量化分析，讓實驗能更迅速、客觀、準確。

圖2：神經細胞加入Methyl mercury培養72小時後，神經軸明顯斷裂、萎縮。

圖3：神經細胞加入不同藥物刺激後，量化神經軸生長情形。

3.原位細胞週期及凋亡檢測分析

監控細胞週期及凋亡狀態是一個非常重要的指標。與傳統檢測方法（如:流式細胞儀FACS）相比，全自動高內涵影像分析系統可對原位（無需懸浮處理）細胞進行全自動成像，並完成單一細胞的多參數分析。如圖4a，藥物作用後進行細胞核染色（藍色： Hoechst 33342；紅色: Propidium Iodide；綠色: YO-PRO-1），並使用高內涵軟體MetaXpress進行細胞週期與凋亡分析（圖4b）。透過細胞核大小與Hoechst 33342螢光強度，即可定義細胞週期階段（如：G2 phase細胞核大小與G1相當，但螢光強度為2倍）。再用細胞死亡染劑的標定，將死亡細胞核標定出來，即可確定在不同條件下細胞週期變化、細胞死亡比率等參數。

圖4：4a 細胞藥物作用後進行細胞核染色（藍色: Hoechst 33342；紅色: Propidium Iodide；綠色: YO-PRO-1）。4b 以高內涵軟體MetaXpress進行細胞週期與凋亡分析，將細胞核大小、螢光顏色、強度等參數定義後，分別以不同顏色標示所處之細胞週期階段，綠色-S phase、藍色-G2/M phase、淡藍色-G1 phase、紅色-apoptotic cell、橘色-dead cell。

4.Long-term single cell tracking、Wound healing assay

利用ImageXpress Nano系統可進行長時間活細胞培養觀測，適用於如cell migration、wound healing等實驗，更可搭配內建MetaXpress軟體進行多細胞定量分析，計算細胞爬行位置、速率、角度，進而可分析chemotaxis、motility等現象。如圖5，透過每20分鐘拍攝一次、連續11小時，各組別分別計算10顆細胞爬行位置，可看出HopQ轉植的細胞motility下降。

圖5：長時間連續觀察單一EV細胞及HopQ轉植細胞的移動情形。引用文獻: Cell Death Dis. 2020 Apr 14;11(4):231.

5.血管新生（Angiogenesis）

透過抑制腫瘤內血管生成，進而抑制腫瘤細胞生長和轉移是抗癌藥物開發常用的方法之一。血管新生的實驗是以細胞型態影像為基礎，探討不同藥物、基因調控下血管生成的過程。此方法需進行3D拍攝方式、Z軸切層並重組影像獲得血管三維生長的完整資訊，藉以尋找抑制腫瘤生長時血管生長的藥物以及訊息傳遞模式。如圖6，在96孔盤中先加入Matrigel形成半固態的透明膠體培養環境，再加入血管表皮細胞（如：HUVEC）。細胞會在膠體中生長出如網狀的結構，最終使用染劑（如：Calcein AM）將細胞染色後使用高內涵系統進行3D拍攝與Best focus的影像平面化（2D projection），即可計算完整血管生成tube length、tube area 、Number of segments、Number of branch points、Number of nodes等參數。

圖6：以高內涵系統拍攝血管新生情形。以3D拍攝後，利用軟體進行Best focus的影像平面化（2D projection），最後呈現影像如左圖即可呈現tube（白色）及node（綠色）。

6.GPCR（G protein-coupled receptor）活化試驗

GPCR佔蛋白表現基因約4%，包含嗅覺、視覺、味覺與細胞生長、免疫反應等都有相關。了解GPCR活化程度、會引起哪些種類的GPCR活化，一直是藥物開發、代謝機轉研究的課題。ImageXpress NANO可分析包含每個細胞GPCR活化程度，搭配GPCR-GFP fusion protein，更可進行即時藥物作用偵測反應。如圖7，ß2AR expressed U2OS細胞受到不同濃度藥物刺激後，GPCR internalization程度可明顯看出差異，透過軟體定量即可算出各個藥物濃度在不同時間的作用結果。

圖7：ß2AR expressed U2OS細胞受到不同濃度Isoproterenol刺激後，觀察GPCR internalization情形。上圖：以高內涵系統拍攝結果。下圖：利用軟體進行定量分析，將細胞以顏色屏蔽後，可明顯看出GPCR internalization（左下圖-紅色小點、右下圖-白色小點）。

7.腫瘤幹細胞細胞異質性研究

腫瘤幹細胞研究是目前新興的一個研究領域，腫瘤幹細胞對腫瘤的存活、增殖、轉移及復發有著重要作用。從本質上講，腫瘤幹細胞通過自我更新和無限增殖，維持著腫瘤細胞群的生命力；腫瘤幹細胞的運動和遷徙能力又使腫瘤細胞具有轉移的可能性；腫瘤幹細胞可以長時間處於休眠狀態，此時腫瘤細胞對能傷害腫瘤細胞的外界因素較不敏感，因此腫瘤往往在使用一般腫瘤治療方法消滅大部分普通腫瘤細胞後，經過一段時間又再度復發。

ImageXpress NANO系統可以運用96微孔盤，針對不同微環境下腫瘤幹細胞群體細胞的異質性、Clone細胞密度、Clone邊緣細胞群狀態、細胞形態、細胞大小、有絲分裂、凋亡狀態、病毒感染率、胞飲情況、脂滴形成等250個左右的參數進行檢查和定量分析。

8.組織切片掃描

高內涵影像系統也可以針對組織切片，進行高解析度掃描和整體影像拼接，如圖8所示，此為小鼠腎臟切片，影像拍攝完後自動進行拼接，再由紅、綠、藍三色疊圖而成。

圖8：小鼠腎臟切片大範圍掃描及自動拼圖

9.H2AX DNA damage assay

無論癌症、老化皆與DNA和染色體損傷有關，輻射照射、化學藥物等都是造成DNA損傷的因素之一，而γH2AX（Phosphorylation of histone H2AX on serine 139）即為早期辨識DNA雙股螺旋斷裂的標記之一，可透過γH2AX形成的數量來判斷DNA damage程度。ImageXpress NANO可進行高通量DNA damage藥物/抑制劑篩選，搭配免疫螢光染色，即可定義細胞在不同種類、劑量的藥物作用情況。

圖9：a.DNA damage assay γH2AX染色示意圖；b.圖中左側為原始影像（紅色：細胞核、綠色：H2AX染色細胞核），右側為使用ImageXpress NANO計算遮罩圖（橘色為判定為H2AX positive 細胞核），可清楚定義一般細胞以及γH2AX positive細胞並算出DNA damage細胞比例；c.DNA damage細胞比率與藥物濃度關係統計圖。

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