新加坡商必帝股份有限公司陳又楷專員

在過去的二十年間，流式細胞儀技術有著突飛猛進的發展，從早期僅可以同時偵測四個螢光，到現今最多可同時偵測至三十個螢光。除了儀器設計上不斷的精進改良，更結合了螢光聚合物的發明與生物細胞學的蓬勃發展，在現今學術期刊發表中，也可以觀察到流式分析的應用層面越來越廣；在臨床端也被視為細胞分群的標準方法學之一，扮演診斷與監控免疫環境變化的重要角色。

BD公司也在2018年推出FACSLyric流式細胞分析儀，承襲穩定的液流系統與靈敏的螢光偵測，搭配直覺化的操作軟體，提供更友善使用的分析平台。在雷射與螢光偵測器配置上，搭載藍光、紅光與紫光雷射，同時可激發10個螢光 (可偵測之螢光與濾片資訊如下圖)，並可滿足八成實驗需求；此系統同時也具有高樣本收集效能 (35,000 cells/sec) 與極低的樣本殘留率 (≤0.1%)。軟體具內建螢光補償數值，上樣時，依據電壓調整即時修正補償數值，達到最簡易使用與高效率的目的，幫助提升研究質量與動能。

在IPA生物路徑分析軟體當中，其分析功能可分為資訊查詢以及數據分析服務，在查詢的部分，您可以透過IPA收錄的數百萬筆生物資訊，快速尋找您感興趣的基因、疾病及分子調控方式。而在分子數據意義分析上，IPA提供多樣的分析與結果表示方式，包含生物訊息核心分析 (Core Analysis)，使用者可將實驗中的基因體、轉錄體或者蛋白質體資料上傳至IPA，並且透過篩選工具選擇出關注分子，利用IPA尋找相關的生物路徑或者疾病與細胞功能。而比較分析 (Compare Analyses) 可利用Heatmap同時瀏覽多筆資料的，將結果進行全面性的比較。

圖一、FACSLyric搭配之螢光偵測器

而流式細胞分析技術是一門定量分析的方法學，透過液流帶動懸浮樣本通過雷射光，當細胞通過雷射時，激發標定於細胞上的螢光物質，最終偵測螢光訊號與散射光，反映出樣本特性，達到鑑別特殊細胞族群等目的。因為使用液流系統推動樣本，每秒鐘可偵測到數千至萬顆細胞，屬於高通量分析方法，也非常適合分析稀有細胞族群。流式細胞儀可應用於各式各樣的分析實驗中，例如標定細胞表面抗原的免疫分型實驗、胞內抗原分析、測定細胞內部DNA含量、細胞週期、細胞增生與凋亡試驗、外泌體檢測等，甚至可以使用流式測定蛋白質的絕對濃度，以下將替大家說明幾種常見的應用。

1.免疫分型 (Immunophenotyping)

免疫分型為流式細胞儀中最常見的應用，透過偵測免疫細胞上特異性抗原或是抗原組合，作為標誌 (Marker)，例如T細胞同時表現CD45與CD3；而B細胞則帶有CD45與 CD19，透過這些特有的標誌，協助我們從樣本中找出目標細胞群。

圖二、6色分析全血中淋巴球細胞

此類型實驗在過去已累積很多的經驗，有許多細胞分群與多色螢光配置的資訊刊載於Cytometry Part A期刊，尤其是Optimized Multicolor Immunofluorescence Panel (OMIP) 專刊，這些多色實驗結果已經過驗證和發表，是開發各種免疫應用的公開分享資源，可作為實驗設計的參考。

OMIP: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/toc/10.1002/(ISSN)1552-4930.OMIPscollection。

2.胞內染色 (Intracellular staining)

除了標記表面抗原進行分型之外，我們也可以透過通透與固定液的處理，在細胞膜表面造出許多微小孔洞，進而偵測胞內抗原，包括細胞激素、轉錄因子與磷酸化蛋白質等，幫助了解細胞特性。例如研究調節性T細胞 (Treg)，已知表面抗原型為CD25^HiCD127^low，其轉錄因子FoxP3也是特定的表現抗原，在內染的幫助下更能精準定義Treg細胞族群。

圖三、淋巴球染色實驗, Treg細胞分型為CD4⁺CD25^highCD127^dimFoxP3⁺ (colored blue)

3.細胞週期分析

真核細胞在環境與狀況良好時，先行複製後進入有絲分裂期，由母細胞分裂為兩個子細胞，此循環稱為細胞週期，胞內染色體的總量隨著每個階段而變化。目前已有多種試劑可供研究細胞週期，例如PI和7-AAD，透過DNA染劑，可觀察DNA含量更迭。如果在細胞週期的S期 (DNA合成) 時期，加入BrdU試劑，BrdU會在複製過程中替代thymidine，並透過BrdU抗體偵測，可取得更精確的效果。

圖四、7-AAD與BrdU合併分析細胞周期之變化

4.微珠免疫分析試驗 (Cytometry Beads Array, CBA)

CBA是流式細胞儀絕對定量的方法之一，用於偵測水溶性蛋白及外泌性蛋白，包括細胞激素、趨化因子、生長因子及訊號傳導磷酸化蛋白等，最高可同時偵測多達30種蛋白質，適用於血清、細胞培養液等樣本。

圖五、微珠免疫分析試驗的簡易流程與步驟

偵測原理主要以螢光微珠為主，每一種微珠上只會接合一種專一性抗體，同時每種微珠的自體螢光強度不一，藉此方法，同一反應中可混合多種微珠，測定多種蛋白。將微珠、待測樣本與偵測抗體混合反應後，上機收取結果。並透過標準品與平均螢光強度 (MFI) 計算出標準曲線，最終換算得待測之絕對濃度。

圖六、以標準品之螢光強度繪製標準曲線

以上說明之應用僅為部份分析實驗，凡能製備為單細胞懸浮液，待測物的粒徑介於0.2 - 50 uM的樣本，皆可以使用流式細胞儀進行偵測。最新研究趨勢甚至將流式分析結果與演算法結合，依照每顆細胞所展現的螢光特性進行計算，虛擬出視覺化的分布空間，幫助了解樣本中所有細胞分群，擴大觀測視野。也期望透過良好的分析工具，支持科學進程，並協助大家探查未知的領域，增加研究的質與量。

圖七、tSNE演算法分析28色螢光標定之健康人血樣與分群結果　

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