萊富生命科技公司 郭正佼小姐

前言

流式細胞儀在臨床醫學研究上，一直因具有能夠快速分析樣品中不同細胞族群之多重特性的優點而扮演著不可或缺的角色。然而，傳統的流式細胞儀受限於液流聚焦系統在樣本高速流動的情況下，細胞會逐漸失去與雷射交會的精準度，因而造成訊號測量結果變異度(CV值)增加、準確度與解析度皆會降低的情形。也因此，在分析樣本時，研究者往往受限於儀器流速的限制(一般小於120ml/min)，須將細胞離心並濃縮在較小的體積中，方可在有限的時間內分析完一定數量的細胞。

什麼是聲波聚焦?

醫研部共同研究室流式細胞分析暨分選核心設施於今年11月份新購置之Attune NxT聲波聚焦流式細胞儀，運用了由前美國Los Alamos國家實驗室首席科學家Dr. Greg Kaduchak率領的團隊在2008年所研發出來的專利技術。其原理為利用超音波在圓形管柱側邊震動產生能量，並藉由此能量促使管柱中的顆粒聚集至正中央(圖一)。利用此原理，可突破傳統流式細胞儀之流速限制，將流速範圍大幅增加至1,000ml /min，卻仍能保持細胞與雷射交會的準確度，得到精準的實驗數據(圖二)。

圖一、聲波聚焦原理示意圖

圖二、聲波聚焦與傳統液流聚焦在不同流速範圍下(A低流速；B高流速)，對細胞與雷射交會準確度之影響

臨床研究的挑戰之一: 分析組織中佔比極低之微量細胞或總細胞數偏低之珍貴樣本

近年來，在臨床醫學研究上最顯著的趨勢，莫過於尋找具有修復功能的幹細胞、調控免疫功能的特殊免疫細胞、與癌症免疫有關的細胞治療目標細胞，以及能夠早期偵測癌症發生的循環癌細胞等，以做為癌症、心血管疾病，帕金森氏症等疾病形成機制、診斷與治療之相關研究。然而，這些目標細胞在組織或血液中往往佔比極低，使得在傳統的流式細胞儀上，必須先利用裂解紅血球、梯度離心、磁珠分離等方式初步去除樣本內絕大多數之非目標細胞，方能在有限之流速範圍內，分析足夠之細胞樣本；但經過以上所述之細胞前處理步驟，不僅喪失了目標細胞在樣本中的原始比例資訊，更可能造成細胞流失、受損、功能改變或活化等問題，導致分析結果的偏差與錯誤。再者，為了分析數量龐大的總細胞數以獲取足夠之目標細胞數據，研究者往往會利用濃縮細胞的方式，將細胞濃度調整至10⁷/ml甚至10⁸/ml，藉此縮短上機分析所需要的時間，卻因此常常造成細胞分布不均、管路堵塞、回收率偏低等問題，導致實驗數據的品質下降。

反之，利用聲波聚焦流式細胞儀，不僅可以大幅增加臨床研究所需之微量細胞樣本分析的速度，更能藉由其可快速分析大體積樣本的特性，將全血樣本或由組織分離之單細胞懸浮液染色，以緩衝液稀釋後直接上機分析(No Wash)；此法可利用稀釋步驟避免細胞過濃所產生的上述問題、降低抗體之非特異性黏結，同時免除掉多餘之離心與清洗步驟造成之細胞流失、受損、功能改變或活化等問題，更可直接計算出目標細胞在原始樣本如全血中之絕對濃度，做為臨床診斷上的重要依據。

同樣，此法也可適用在當取得的臨床樣本細胞數相當有限且珍貴時，利用免洗步驟並放大上樣的體積，即可避免細胞丟失，大幅增加回收率。

臨床研究的挑戰之二: 容易沾黏之腫瘤樣本

再者，由於腫瘤細胞容易沾黏的特性，以空氣壓力驅動樣本進入管路的傳統加壓式流式細胞儀，一遇到腫瘤樣本便常常容易發生堵塞的問題，使得分析益發困難。Attune NxT聲波聚焦流式細胞儀採用了新型之針筒幫浦驅動，利用幫浦本身遇到前端些微阻塞時產生之壓力回饋，可大幅增加進樣壓力，避免因腫瘤細胞團塊造成之管路堵塞，大幅降低儀器的故障率。(圖三)

圖三、A:傳統壓力式進樣原理；B:針筒幫浦進樣原理

臨床研究的挑戰之三: 外泌體Exosomes分析

利用流式細胞儀直接偵測外泌體上的表面抗原，藉此得知外泌體來源與特性是近期許多臨床研究者亟欲挑戰的項目之一。Attune NxT聲波聚焦流式細胞儀具有以下幾項特色，使得其在分析外泌體的實驗上具有相當的優勢:

1. 利用聲波聚焦功能，可大幅降低鞘液使用量至每天少於1.8公升。此特性搭配需要使用超微孔過濾膜(0.025mm)過濾之鞘液方可降低背景雜訊之外泌體分析，可節省大量過濾鞘液所需時間，利用少量鞘液即可完成實驗。

2. 優異的光學靈敏度與可抽換式VSSC(Violet Side scatter)濾片，搭配細胞膜染劑螢光訊號(如FM 1-43)可清楚分析外泌體表型(圖四)。

圖四、外泌體表面抗原分析範例

Data from Steve McClellan, Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama: Analysis of Surface Antigens on Exosomes  Using the Attune NxT Flow Cytometer(Webinar: https://www.youtube.com/watch?v=CSXwXeek2Lc )

總結

運用上述Attune NxT聲波聚焦流式細胞儀之特點，可以幫助臨床研究人員克服樣本分析的種種挑戰，第三共同研究室流式細胞分析暨分選核心設施也將於近期舉辦正式開放服務之儀器說明會與教育訓練，歡迎有興趣的同仁踴躍參與!

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