醫學研究部 吳侑靜 博士後研究員

次世代定序(NGS)相比傳統的檢測技術有著明顯的通量優勢，核酸質量的高低對於 NGS 測序結果影響非常大，定序需要從組織、細胞、或微生物等來源純化並放大目標核酸。而進一步處理核酸樣本前，應先針對其濃度、純度、以及完整度執行品管。在進行第二個工作階段前，必須精確測量核酸濃度，符合進樣量需求才能進行基因庫建庫之流程；純度的測量在於樣本若遭其他核酸或化學物質污染，則可能導致雜訊過多或定序酵素之靈敏度與效率下降。此外，若核酸片段完整度不高，則會造成定序資訊不全或污染訊號無法分辨等情形。以上因素都將衝擊定序結果和品質。

基於有些樣本很珍貴不易取得，但所萃取出的核酸質量卻很低 (濃度<10 ng/ul且總量<100 ng)，又想做NGS分析，該怎麼辦呢? 因此近幾年試劑廠商紛紛針對這類低濃度、高降解樣本作開發，目前從核酸萃取到基因庫製備已有不少試劑可以做選擇。不過這類樣本由於濃度跟總量都不高，會面臨需要犧牲已經很稀少的總量來做品質鑑定，但即使這樣的犧牲也常常得到片段分析訊號微弱甚至於看不到訊號的窘境。以下分享本核心在這類檢體上的相關操作經驗與試劑選擇。

根據常見易得到核酸完整度及濃度不高的樣本種類列出相對應之核酸萃取策略及品質檢測結果

1.經過流式細胞儀分選後的細胞(Sorted cell)

為了研究不同群細胞的反應，使用者通常會先使用流式細胞儀將細胞做分群，縮小目標後再做RNA-seq檢測基因表現差異。但經過流式細胞儀分選後的細胞，往往存活率及細胞品質都無法評估，因此得到的核酸完整度差異大。

2.組織(Difficult tissues)

常見不易萃取出高質量之組織，包含高纖維組織(fibrous tissue) 如血管及心臟、硬組織(Hard tissue)如骨頭及軟骨、核酸酵素含量高之組織(Nuclease-Rich Tissue)如皮膚。要從這些組織得到品質良好的核酸，關鍵是均質步驟，此時選擇合適的均質機搭配建議的研磨珠子可大大提升取得核酸的品質。

3.石蠟包埋(FFPE；Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded)的檢體

臨床樣品如腫瘤組織等，因需要被長期保存，大多會先用福馬林固定後包埋在石蠟塊中，以切片玻片標本提供日後病理觀察與診斷之用。從這樣的樣本中所取回的可用核酸，能被用來追蹤該檢體標本在取得當下所表現的基因狀況以及所帶有的基因序列變異，是個寶貴的基因資料庫。但福馬林會讓蛋白質與核酸形成鏈結，破壞核酸原本的結構，因此無法得到完整的核酸，通常會依據取得之核酸長度及>200bp核酸比例(DV200)來評估其完整度。此類樣本之核酸萃取依除蠟的方法可分為兩大類如下表。

低質量之核酸樣本基因庫建庫試劑選擇，針對實驗目的分為下列兩大類：

1.Whole transcriptome library

實驗目的：全面性觀察基因表現變化，篩選出可能參與的基因或訊息傳遞路徑。

2.Targeted DNA/RNA library

實驗目的：增加目標基因之定序深度，可增加靈敏度，偵測低比例之變異，可應用於研究特定訊息傳遞路徑(Signal pathway)變化、檢測SNV、InDEL、Splice variants與Fusion Gene。

NGS實驗的執行，除了需評估樣本品質與選擇合適的建庫試劑外，樣本數、定序深度與預算也是需要被考量因素。本核心有提供免費的實驗設計諮詢服務，歡迎在建構實驗前跟我們討論，我們會協助大家選擇符合實驗需求的的次世代定序策略。

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