ELISPOT (Enzyme-linked immunospot)，亦可稱為ImmunoSpot；此分析方法發展之初是為了偵測B細胞所分泌的微量抗體。一般而言，偵測外泌性蛋白的常用平台為ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)，ELISA是待細胞完成分泌反應之後，取其培養液進行免疫聯酶反應，若細胞所分泌的蛋白濃度太低，往往無法被偵測到。在1983年，Dr. Cecil Czerkinsky改良實驗流程，將capture antibody附著在培養盤底部，再將細胞連同刺激物(例如:抗原)加入一同培養。若細胞受到誘導產生外泌性蛋白，就能立即地被培養盤底部的capture antibody抓取，避免稀釋在培養液中，接著進行類似ELISA的呈色反應(圖一)。在1996年Dr. Paul Lehman應用PVDF作為ELISPOT的底盤，改善原本塑膠培養盤對抗體的親合力差的問題，進而開發出世上第一台ELISPOT分析儀，讓ELISPOT被廣泛採用。

          圖一、ELISPOT原理

在ELISPOT實驗流程中，抗原特異性T細胞(antigen-specific T cell)會與抗原呈現細胞(APCs)和特定或欲測試的抗原(antigen)一起培養來模擬免疫反應，後續進行呈色(如圖一)，最後由細胞免疫影像分析儀自動掃描96個樣本，耗時大約2分鐘，再由分析軟體進行斑點數目分析與資料處理，藉由每個well產生多少個斑點(Spots)和斑點大小作為免疫反應的指標，來推論活化T細胞顆數與其分泌相對應量的cytokine。

在傳統ELISA、CBA (cytometry Beads array)、ICS(intracellular cytokine)或RT-PCR所得到的數值中，研究者無法明白有多少數目細胞分泌特定的cytokine，難以區分是少量細胞分泌大量的cytokine或大量細胞分泌少量的cytokine，而這些檢測數據皆代表重要的研究資訊。人類PBMC在沒有任何抗原刺激下，細胞本身就會分泌少量的cytokine，經過正確的抗原刺激後才會產生大量且專屬的cytokine，例如:以HIV感染患者的PBMC偵測IFN-γ時，正常人和患者在IFN-γ形成的斑點數上並無明顯差異，但病患的斑點大小卻只有正常人的1/10，所以HIV並不是影響病人體內活化T細胞的數目，而是抑制了活化T細胞分泌INF-γ的能力。由ELISPOT可反映出細胞分泌細胞素(cytokines)的真實狀況。此外，ELISPOT可應用在偵測疫苗施打後的細胞記憶性，例如:疫苗施打後，取出免疫細胞與專一抗原或peptides培養後進行呈色反應，由斑點的大小與多寡可得知測試的疫苗是否可以喚起免疫細胞的記憶性，進而產生細胞素或抗體反應。

近年來，ELISPOT儀器發展快速，陸續有雙色免疫斑點分析(Dual Color ELISPOT/圖二a)和螢光免疫斑點分析(FluoroSpot/圖二b)的機種出現。

圖二a                             圖二b

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流式微粒螢光分析儀

xMAP (Multi-Analyte Profiling) technology 是利用傳統免疫聯酶反應來達到同時分析多種標的之multiplexing技術平台，為Lunimex公司的專利技術。有別於一般ELISA方法將抗原附著在培養盤底部，xMAP technology是先將antibody (probe)接合在具有螢光A的5.6μm polystyrene bead 或 6.5μm magnetic bead (新一代beads)，與待測樣品反應後，若樣品內含有相對應之標的物antigen (cytokines、chemokines、growth factors等)，即會接合上此bead。再來，加入會與該標的物反應的第二種antibody(含有螢光B標定﹔(如圖三)。不同抗體可設計結合在不同螢光強度的polystyrene beads，經雷射激發後可以被鑑別出來。更重要的特點是數百種帶有螢光A的beads結合物與帶有螢光B的對應抗體，因專一性可與數百種標的物結合，可以在同一次反應中進行。

圖三

接著，利用流式微粒螢光分析儀來分析實驗的結果。目前市面上有多家不同廠牌的分析儀可使用，第七共研目前使用的是Labscan100。此儀器是一台類似流式細胞儀的96孔盤分析儀，具備二支雷射光源(如圖四)。一支為Bead Classification Laser，可以區別鑑定出100種以上不同螢光染劑的polystyrene beads (圖五)，因此一個反應孔可偵測100種以上標的物，以達到multiplexing目的﹔另外一支則為Reporter Laser，用以偵測antibody或核酸上的螢光B標的。配合實驗所建立的定量標準曲線(標的物濃度vs.螢光量)，即可推測樣品內不同標的物的含量，例如:同時偵測血漿中促發炎cytokines (IL-2, INF-γ)和抑發炎cytokines (IL-4, IL-10)的含量。

圖四

圖五

每一個反應試管中最少需要12μl serum或50μl的cell lysate，對於珍貴的實驗樣品，例如組織及腫瘤切片、小鼠血液或新生兒血液的分析，即可藉由xMAP technology分析套組和微粒螢光分析儀達到multiplex detection的目的。此系統應用在蛋白質(cytokines、antibody isotyping、chemokines、growth factors及phosphoproteins)的分析。此外，儀器也可以應用於xTAG （xxxxxx）technology平台，主要是進行核酸(病原菌、病毒、基因表現及SNP)的分析。

使用說明

第七共同研究室提供「細胞免疫影像分析儀」與「流式微粒螢光分析儀」，歡迎研究人員使用。研究人員參加講習後可自行操作儀器。實驗室管理人員為袁惠萍小姐，分機:63162，電子信箱 hpyuan@ntuh.gov.tw，若有任何問題，歡迎來電或來信討論。
　

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