醫學研究部定序核心實驗室

傳統多重基因分析技術例如微陣列分析(Microarrays)和大量細胞的核醣核酸基因定序(RNAseq)，是依賴多量細胞上的基因測量平均值，藉以觀察和比較正常細胞群與異常細胞群之間的差異。此類檢測方法會因為基因引子(Primer)的設計，導致鏈聚合酶擴增(PCR)後的基因數目與細胞內的原始基因母本數目(copy number)有著極大的差異；另一個問題是極少量異常的基因會被大量細胞的高度表達基因之平均數值所稀釋。上述二個限制使得真正需要被檢視的極少量基因無法被偵測出來。

目前最新的技術是運用磁珠上的核酸序列包括poly dT、獨特分子索引序列(UMI, Unique Molecular Index)、細胞標定序列(CL, Cell Specific Sequence)以及專一引子序列(Univ, Universal Sequence)來做單一細胞的文庫製備(Library Preparation)，再到Illumina次世代定序儀(NGS)讀取其上的核酸序列資訊。

其中最重要的關鍵是獨特分子索引序列(UMI, Unique Molecular Index) 。經由第一次反轉錄的每一條cDNA其序列上都會有獨特的分子索引，如果是相同的基因轉錄子(Transcripts)其分子索引有兩種，代表此基因有兩個母本數目(2 copy numbers)，三種分子索引則代表細胞中有3個母本數目。此方法運用了大量單細胞平行檢測分析的技術，每個磁珠上具有數以百萬計的核酸序列，這些核酸序列設計包含此磁珠專屬的單細胞標定序列(CL, Cell Specific Sequence)，以及上述poly dT、多重獨特分子索引序列(Unique Molecular Index)和專一引子序列(Universal Sequence)。在細胞卡匣的每個微孔(micro well)中的單一磁珠結合單顆細胞後，細胞經水解試劑反應所釋放出的訊息核醣核酸 (mRNA)會結合在poly dT上，運用磁座將磁珠吸附在微孔壁上，再將上清液去除後得到純化的訊息核醣核酸(mRNA)。由於每個磁珠皆有其專屬的單一細胞特異性序列(CL, Cell Specific Sequence)，因此可將這些結合了訊息核醣核酸(mRNA)的磁珠收集在一起做同步的反轉錄及相同基礎的鏈聚合酶擴增放大(PCR)，此技術可在單一試管內的數以萬計細胞中區別出每個細胞的基因表達分析。而細胞微孔卡夾隨時可用高解析度細胞掃瞄儀偵測細胞狀況，例如活細胞比例、細胞形態及細胞碎片等資訊，以做為是否要做次世代定序(NGS)的依據。

此方法為真正的數位化基因絕對定量方案，每一個cDNA上都有相同的專一引子序列(Universal Sequence)，使得其後的鏈聚合酶擴增放大(PCR)都在相同的基礎下進行，讓每一個cDNA都有相同的擴增放大效率，從而免除了因為引子(Primer)序列的不同，導致每個基因的擴增效率不同而產生最終產物與細胞內原始基因母本的極大誤差。此技術主要應用於目標基因表達(Target Gene Expression)，因此可避免高量存在的Housekeeping Genes也被定序，可大量地節省後續次世代定序(NGS)的成本，並提升稀有基因的偵測敏感度，適合臨床檢測的應用。廠商為考量到研究發現(Discovery)的應用，最近也發表了全基因組(WTA, Whole Transcriptome Analysis)的方案。

  

另有廠商發表的膠體微珠(Gel Beads)技術，其膠體微珠表面具有獨特分子索引序列(UMI, Unique Molecular Index)，當細胞和膠體微珠被油滴包覆後，以微流體將油滴分離出來並做後續的次世代定序(NGS)的單細胞基因分析。由於使用油滴併合微流體技術，油滴內可能包覆2顆以上細胞(Doublet)在操作過程中無法得知細胞狀況，例如活細胞比例、細胞形態及細胞碎片等資訊。必需等到次世代定序的結果才能得知原本細胞的狀況。

我們還可以進一步延伸至細胞表面蛋白質標記的分析。傳統的方法是使用螢光單株抗體來標定細胞，再使用螢光顯微鏡或流式細胞儀檢測。新一代的技術，是將每種單株抗體標定其相對應的核酸序列。當含有特定核酸序列的抗體和細胞結合後再被磁珠抓取，同樣可以用Illumina次世代定序儀讀取序列資訊以分析細胞表面的蛋白質標記。

單一細胞內的基因表達和細胞表面的蛋白質標記分析可以同時進行，其好處是整個實驗是在同一微孔中發生，如此可以避免不同批次的實驗誤差，讓我們進行精確的多體學研究。例如抗癌藥物是在癌細胞的轉錄層次（Transcription）、轉譯層次 (Translation)還是蛋白質活化的阻斷產生影響。

針對極稀少珍貴的細胞，我們可先以細胞分選儀將具有相同表徵型(phenotype)的細胞分選濃縮，再進行單一細胞多體學(Multi-omics)分析，如此可大幅度縮短稀有細胞族群例如體外循環腫瘤細胞(Circular Tumor Cell, CTC)的研究時程，同時也免除其他高表達細胞族群的干擾。

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