醫學研究部共同研究室

想應用NGS技術於轉錄體(RNA)的研究，卻不得其門而入嗎? 本期電子報簡單地介紹RNA的種類，並提供相對應之基因庫試劑的選擇要點給研究同仁做參考喔! 下一期電子報主題為「3D腫瘤測量儀介紹」，敬請期待，並竭誠歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器介紹、研究新知、與每月訓練課程資訊，更歡迎您與我們聯絡，給予我們建議與鼓勵。

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醫學研究部-吳侑靜博士後研究員

為了瞭解生命體內基因的活動，最直接的方法就是觀察細胞內RNA的表現情形(Fig. 1)，即轉錄體(transcriptome)的資訊。經由比較RNA表現的差異，研究人員可推論出調控的網絡及其功能並加以驗證，臨床上更能藉此找出治病的關鍵基因或診斷用的生物標記(biomarker)。而利用高通量的次世代定序技術，結合生物資訊學的分析，為轉錄體相關領域的研究中帶來許多重大的突破。

Fig.1 細胞內RNA (Chan and Tay, 2018)

而 RNA有很多種類，各負責不同的功能 (Table 1)，可在遺傳編碼、轉譯、調控及基因表現等過程中發揮作用。依RNA功能分類，我們將具有編碼蛋白質能力的mRNA稱為coding RNA，而其他沒有編碼蛋白質能力的RNA則被稱為non-coding RNA (ncRNA)，它們會經由催化生化反應調控基因表現的過程，並發揮相應的生理功能。近幾年的研究發現ncRNA彼此也會互相調控，例如有些long non-coding RNA (lncRNA)會透過與miRNA競爭結合的方式，間接影響miRNA對mRNA轉譯的抑制作用，此現象稱為the competing endogenous RNA假說(Salmena et al., 2011; Tay et al., 2014)。由此可見轉錄體的調控網絡之複雜，還有很多未知等待研究人員去解開。

Table 1. RNA種類及功能

種類		功能
Protein-coding mRNA		可轉譯成具功能性的蛋白質。
Short non-coding RNAs (<200 bp)	microRNA (miRNA) 21-23bp	與mRNA的3’UTR結合導致mRNA被degrade無法轉譯。
	Piwi-interacting RNA (piRNA) 24-31bp	存在於生殖細胞中，會與Piwi蛋白結合形成piRNA complex，調控配子基因表現。
	small interfering RNA (siRNA) 20-25bp	Double-stranded RNA，具專一性的方式使RNA degradation，進而調控蛋白質表現。
	transfer RNA (tRNA) ribosomal RNA (rRNA)	參與mRNA轉譯。
	small nucleolar RNA (snoRNA)	可引導RNA的化學修飾 (如methylation)，作用的對象包含rRNA及tRNA。
Long non-coding RNAs (>200 bp)	long intergenic ncRNA (lincRNA)	可調控細胞的reprogramming。
	pseudogenes	在一個基因家族中會存在因演化突變過程中所產生的垃圾DNA，近年發現可能扮演基因調控的功能。
	circular RNA (circRNA)	Circular RNAs (circRNAs) 是一種經過backsplice circularization形成環型的noncoding RNA (ncRNA)，circRNA可與microRNA及RNA-binding proteins結合，進而調控其功能。
	antisense RNA (asRNA)	與mRNA互補的single-stranded RNA，經由與mRNA結合抑制其轉譯。

複雜的轉錄體調控網絡需要全盤的觀察才能得到正確的切入點，而高通量的次世代定序技術則為研究人員的首選，但是基因庫的種類繁多該如何去選擇呢? 首先研究人員需要考慮幾個要點，包含：

a.實驗的物種

除了mRNA-seq以及small RNA-seq因設計原理適用於各物種外，其他的targeted RNA-seq大部分都是利用primer或probe的方式針對哺乳類做設計，與cacner相關的基因庫大多只針對人類。

b.欲觀察的目標RNA

依實驗需求可利用次世代定序的方式觀察到各種類的RNA，包含coding RNAs及non-coding RNAs，個別適用的RNA-seq種類詳述於下列資訊。

c.樣本數

由於目前現有的基因庫試劑大多為12或24樣本為一組包裝，在樣本數少的情況下，會有試劑成本太高的狀況。

d.試劑對RNA品質及濃度的要求

因設計原理的關係，如果要看到較接近於真實的結果，基因庫的建構需要高品質的RNA，這部分有時會因為組織的特性而不易得到高品質的RNA，也是研究人員需要考慮及突破的關鍵。然而降解的RNA如果要看其表現，也可使用primer或probe的方式將要看的區域抓取下來做定序，但目前大多只適用於人類或其他哺乳類。另外由於single cell定序的崛起，RNA low input的需求也變高，也出現許多相關搭配的前處理試劑。

e.所需的定序深度

待基因庫製備完成，後端定序往往是決定預算的關鍵，通常深度越深數據量越多，相對預算也會比較高，是研究人員需要考慮的因素之一。

依據上述幾個要點，以下整理出目前次世代定序主要常見的轉錄體定序(RNA sequencing)：

1.mRNA sequencing

可得到的資訊	mRNA、lincRNA、pseudogenes
物種	適用於各物種 (具有poly-A結構之RNA)
RNA要求	需要高品質未降解的RNA
定序深度	10-25M reads
原理	使用Oligo-dT beads 擷取具有polyA tails結構之RNA，並轉成cDNA做定序，再利用dUTP替代dTTP方式，讓2nd strand生成帶有dUTP，在之後PCR步驟中，PCR Polymerase會因2nd strand帶有dUTP而不會被放大，藉此保留精確mRNA Stranded資訊。(是否有stranded依試劑而不同)

2.RNA exome sequencing

可得到的資訊	基因的coding及UTR區域、RNA fusion
物種	現有的試劑只針對human
RNA要求	適用於FFPE樣本及降解RNA樣品
定序深度	10-20M reads
原理	利用大量的probe，擷取RNA coding序列設計。擷取的RNA轉成cDNA做定序，再利用dUTP替代dTTP方式，讓2nd strand生成帶有dUTP，在之後PCR步驟中，PCR Polymerase會因2nd strand帶有dUTP而不會被放大，藉此保留精確mRNA Stranded資訊。

3.Total RNA sequencing

可得到的資訊	mRNA、lincRNA、pseudogenes、cirRNA
物種	現有的試劑大多針對human或哺乳類
RNA要求	適用於FFPE樣本及降解RNA樣品
定序深度	40-50M reads
原理	去除RNA中佔80-90%的Ribosomal RNA，再將剩下的RNA轉成cDNA做定序，再利用dUTP替代dTTP方式，讓2nd strand生成帶有dUTP，在之後PCR步驟中，PCR Polymerase會因2nd strand帶有dUTP而不會被放大，藉此保留精確mRNA Stranded資訊，保留更完整的生物訊息。

4.small RNA sequencing

可得到的資訊	short non-coding RNA (包含miRNA)
物種	適用於各物種
RNA要求	需要高品質未降解的RNA
定序深度	4-8M reads
原理	利用特別設計的 3’ RNA adaptor 鎖定帶有3’ hydroxyl group的miRNA 或small RNA族群建庫。再針對18-40nt範圍的small RNA進行切膠，或使用bead-based的方式純化small RNA基因庫，再進一步定序。

5.targeted RNA sequencing

可得到的資訊	不同訊息調控路徑、免疫相關、癌症相關panel (依各廠牌而異)，也可以依需求做設計，除了表現量外，可分析isoforms，splice junctions，gene fusion和cSNP變化。
物種	現有的試劑大多針對human或哺乳類
RNA要求	適用於FFPE樣本及降解RNA樣品
定序深度	依primer或probe數而有異 (0.5-8M)
原理	利用Multiplex PCR的方式搭配定序可同時檢測多重靶向基因表現量及序列。

希望本電子報的資訊能讓研究人員更有效率地踏出第一步，利用高通量次世代定序技術研究轉錄體的調控，發現具有重要調控功能的RNA並觀察這些新的RNA分子在細胞內的表現。

參考文獻

Chan, J.J., and Tay, Y. (2018). Noncoding RNA:RNA Regulatory Networks in Cancer. International journal of molecular sciences 19.

Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., and Pandolfi, P.P. (2011). A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell 146, 353-358.

Tay, Y., Rinn, J., and Pandolfi, P.P. (2014). The multilayered complexity of ceRNA crosstalk and competition. Nature 505, 344-352.

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