尚博生物科技公司-楊利君 先生

前言

流式細胞分析術自1972年商品化以來，以高速多參數分析的特徵，成為細胞生物學研究領域中相當實用的工具。藉由多重螢光染色以及流式細胞儀直觀的多參數散點圖呈現，搭配特有的圈選(Region)、設閘門(Gating)等功能，大幅增加實驗設計上的彈性，以及數據統計的靈活度，然而，流式細胞技術對於細胞型態及螢光分布等訊息的提供卻是相對貧乏。再者，某些無法製備為懸浮細胞的特定樣本 (例如實體腫瘤)，或是經trypsin處理脫離培養環境後即喪失活性或是相關資訊的樣本(例如血管或神經生成)，都不適用於流式細胞技術，需仰賴影像分析的方式加以解答。最近這20年間，生物影像分析的發展有長足的進步，逐漸從傳統的定性，前進到了半定量分析，甚至達到單細胞水準，第二共同研究室顯微影像核心於2018年新增的全景組織細胞分析儀TissueFAXS系統是一整合了流式細胞技術與影像分析優點的自動化掃描分析平台，能降低高階影像分析的門檻，其工作流程如下圖所示。

TissueFAXS全景影像自動掃描成像：

TissueFAXS Plus系統是以Zeiss高階自動化螢光顯微鏡Axio Imager Z2 為基礎，配合大型高精度自動掃描台以及高解析相機，透過整合軟體進行螢光及穿透光對組織玻片或是細胞玻片進行全自動影像擷取。目前第二共同研究室顯微影像核心所配備的機型一次最高可執行8張玻片的自動掃描。

全景組織影像分析：

TissueGnostics的免疫組織化學定量分析軟體具有專利設計的演算法，可將多色的組織染色圖檔進行拆色，以下圖為例，淋巴球浸潤的腫瘤組織以Hemalaun-Blue標定細胞核，並以Anti-CD3-Fast Red標定T細胞，透過自動分色演算法，能夠從RGB疊加的彩色影像中拆分出細胞和單染的藍色影像，同時也分離出CD3的紅色影像，以利提升後端定量的精準度。

為了達到單細胞分析的條件，每一個counter stain標示的物件，都必須被軟體自動辨識並圈選，這個過程稱為Cell Segmentation。當細胞與細胞間存在明顯間隔時（例如8成滿的細胞培養盤），這個演算相對單純，然而當樣本是實體組織時，因為細胞肩踵相接過度密集，再加上異質性的細胞型態以及組織切片造成不完整的細胞結構，大幅增加軟體辨識細胞的難度。TissueGnostics專利設計的細胞辨識演算法，針對細胞型態，大小，邊緣特性，狹長程度，染色深淺以及前景背景差異等十數個條件進行評估，在複雜的組織樣本中進行單細胞圈選，並透過專利動態演算邏輯，偵測標定細胞之細胞核/質/膜以及亞細胞顆粒（如下頁圖示），提升組織樣本中單細胞分析的精確度，可將病理切片分析由傳統的定性邁向定量。

樣本經過segmentation圈選標定後，便會根據其呈色深淺(IHC/IF)以灰階色進行量化，包含強度、形態等統計參數共計18種，最後依照使用者定義繪製數據結果。TissueFAXS系統特別以流式細胞分析的概念，將各個細胞條列式數據檔案以二維散點圖或是單參數組織圖呈現，因此可以看見樣本之間的差異。同時，搭配專利設計的正向圈選及反向圈選功能，點擊影像中被標定的任一細胞，便能對應呈現在圖譜中相對位置，反之，在數據圖譜中圈選特定區域，也能將該圈選區內的細胞標定於全景影像中。藉由這個特別的功能，使用者可以用正向圈選方式，在影像與數據間來回確認，訂定明確的陰陽族群分線，也能透過反向圈選了解目標細胞群在實體組織中分布的狀態，進而實現組織樣本原位分析的精神。

使用流式細胞分析的數據呈現方式除了有上述的優點外，另一好處便是能夠進行布林邏輯序列圈選。由於組織樣本具有複雜度高，完整性低的先天缺憾，即使使用TissueFAXS專利設計的細胞辨識演算，依然會有一定比例的圈選失誤（Segmentation failure），這個問題的嚴重程度與樣本特徵和製備過程有正相關。布林邏輯序列圈選是以交集聯集的概念，將複雜組成的物件加以分類篩選，在流式細胞分析中，常被用於淋巴球亞型分群，非常適合用來排除組織樣本的圈選失誤。如下圖所示，最常見的圈選失誤便是團塊與碎片的干擾，我們可以利用細胞核大小的散點圖進行第一次篩選，根據正向圈選的方式，尋找並圈選散點圖中符合大小的目標細胞族群，再將該族群導入（Input gate）顯示細胞邊緣平滑度的散點圖，篩選掉邊緣不規則細胞（常來自於非特異性的background），再將符合大小條件以及平滑程度的目標細胞導入細胞狹長度圖譜中，篩選掉狹長細胞核的族群（例如許旺氏細胞與部分腫瘤細胞），經過序列圈選後的樣本便是符合大小，邊緣完整的圓形細胞。藉由這個專利的設計，能將複雜的組織樣本去蕪存菁，使分析更加精準。

模組化多層次高內涵分析系統：

模組化多層次高內涵分析軟體將實驗內涵提升為多層複合式分析邏輯（Multilayer analysis），並以高達16位元的數據分析格式，提供更高解析的定量結果。全新的分析軟體應用Analysis Layers的概念，允許在同一個組織樣本中，套用多組演算方案，連續分析各自獨立的目標物，並可任意堆疊套用各個Layers進行複雜的邏輯分析。例如下圖所示，在腫瘤浸潤淋巴球的研究中，軟體先利用組織緻密程度的差異，自動偵測並標定腫瘤區與基質區，建立腫瘤分析區域（Layer 1）以及基質分析區域（Layer 2），再利用單細胞辨識方式標定CD8陽性的T細胞（Layer 3），同時利用孔洞偵測邏輯，自動標示血管位置（Layer 4），最後將Layer1~4堆疊分析，便可以知道浸潤於腫瘤區的CD8+T cell的比例，與浸潤於基質區的差異，同時可以了解這些淋巴球從血管向腫瘤侵入的深度。目前已將數種複雜的分析方案製作成簡易操作的商品化App，涵蓋臨床及基礎研究，例如脂肪細胞定量，FISH點分析，淋巴球浸潤分析，Her2-neu 乳癌分析，Ki67 細胞增生和利曼什原蟲症等，使用者也可以透過協助開發個人化專屬的分析App，藉由這些多層次分析邏輯的方法，便可針對擁有複雜內涵的組織樣品抽絲剝繭，進而瞭解目標細胞在組織中扮演的角色與定位，研究其與鄰近組織或其他細胞的互動關係等精密分析，實踐所謂“Tissue Sociology（組織社會學）”的研究，這樣的概念呈現組織切片樣本原位分析的重要性與功能，讓病理切片的分析走進下一個世代。

歡迎各位使用TissueFAXS系統進行數位化病理及高內涵細胞分析，以流式的語言訴說您的生醫影像裡豐富的故事！

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全景組織細胞分析儀使用說明

全景組織細胞分析儀位於二共顯微影像核心，由專職技術員提供委託操作服務，須電話預約技術員服務時段，詳細預約時間表可參看醫學研究部儀器預約網頁，歡迎有需要的同仁與我們聯繫。聯絡人：孫芸鈺小姐、林容瑋小姐。分機：63206。

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