禮文股份有限公司 產品技術部

　

再生醫療及細胞治療是台灣醫療研究的趨勢，除了大家普遍重視的癌症研究之外，幹細胞研究也逐漸受到重視，有鑒於日本在此領域打先鋒，我們發現日本發展出許多優化的培養利器，共通點在於創新的3D細胞培養模式使其更貼近生物體的表現，最終發展成類器官培養，是促使研究進展的重要關鍵。

以下說明其中兩種主要培養工具的原理及應用:

(1) 3D細胞球體培養盤

癌症研究優化—類器官培育(Organoids)

類器官是現今討論度最高的 3D 多細胞體外(in vitro)組織培養的結構體，3D細胞球體是其中最常見的一種，雖然目前有很多不同的技術可使細胞形成球狀體，但他們的概念基本上是相同的。大多是使細胞無法附著於培養皿底部，驅使細胞間相互連結而形成球體型態。基本上，可分為兩種方式：1)使細胞生長在支架間。2)強迫細胞在懸浮液中生長。NanoCulture Plate (NCP) 培養3D 球體結合了支架與懸浮的特性，相較於其他培養方式，NCP仍保有貼附特性，培養時無需添加 growth factor，無異種物質疑慮。目前已有多篇文獻指出，由NCP培養出的3D球體更能模擬體內狀態，可表現內低氧現象(hypoxia)，並可觀察到球體外間質膜(ECM) ，還可進一步做共同培養(co-culture)。

　

          

NanoCulture Plate (NCP) 外觀圖                         細胞球體生長於NCP上

★應用實例

A. 高通量藥物篩選

美國安德森癌症研究中心(The MD Anderson Cancer Center siRNA Core Facility)Dr. Iles、Dr. Bartholomeusz以NCP培養3D球體，將RNAi透過脂質運送到目標細胞進行transfection，做高通量RNAi篩選的應用[1]。

球狀體形態的變化是3D細胞培養另一個獨特的判定準則，傳統的抗癌藥物篩選，是透過測定該化合物是否抗增殖(anti-proliferative)或促進細胞凋零(pro-apoptotic)的活性來判定，但當篩檢的化合物沒有對細胞存活率產生影響而是造成球狀體形態的改變時，結合NCP與影像設備便可輕易的觀察到此變化。

B. 缺氧研究

刊登於PLos One的2016年文獻中使用NCP將腫瘤細胞培養成球體後，使用低氧探針測定球體內部低氧特性 (hypoxia) 做為重要指標，建立抗EMT現象的高通量篩選平台，對1330種化合物進行篩選後，發現對A549給藥後，SB-525334 ( TGFβR1 inhibitor) 及SU-9516(CDK2 inhibitor) 這兩種藥物對細胞具有對抑制EMT現象顯著效果[2]。

在NCP上培養出的球狀體，由於細胞之間的緊密連結，造成球狀體在培養三天後會產生缺氧的核心。此球體結構與實心的腫瘤相似，缺氧核心被一層停止增殖的活細胞包覆，最外層再被增殖細胞包覆。球狀體的分層結構由於內部缺氧，會使球狀體內不同位置的細胞產生不同的基因表現進而造成細胞不同的生理反應，例如血管內皮生長因子(VEGF)這類的上游基因，或其他血管生成相關基因。球狀體內部缺氧的區域可以輕易的被缺氧探針偵測到，只需在觀察前24個小時，將此種無毒試劑添加到NCP培養盤即可。若細胞內部缺氧，核心處會發出紅色螢光，因此可以使用一般的螢光顯微鏡來確認球狀體是否形成缺氧。

C. 共同培養

在體內或腫瘤內，細胞並不會以2D單層平面生長且不會只和同種細胞生長。NCP技術提供了一個貼近生物體的平台，使一種以上的細胞能夠共同培養在穩定的球狀體內。在2013年AACR會議（芝加哥）中[3]，已證實胰腺癌細胞與胰腺癌相關的纖維母細胞能成功地共同培養。在該實驗中，將胰腺癌細胞（紅色染料）與胰腺癌或肺癌的相關纖維母細胞（綠色染料）共同培養。正如所見，胰腺癌細胞與胰腺癌的相關纖維母細胞形成了穩定球狀體(黃色螢光)，但不會與肺癌的相關纖維母細胞形成球狀體。實驗中所得到的共同培養技術，不僅提供了腫瘤生物學新的視野，更給予了高含量藥物篩選新的基礎。

(2) 拋棄式微型生物反應器

再生醫學研究

隨著幹細胞臨床研究的擴大，細胞數須達10億個以上時，傳統培養方式不堪負荷，因此日本ABLE公司推出創新的拋棄式微型生物反應器 (ABLE Bioreactor)，利用特殊專利設計Δ型攪拌葉，在生物反應器內形成穩定橫向的層流(Laminar Flow)，藉此降低對細胞產生的剪應力(Shear Stress)，對於iPSC、ESC、MSC等幹細胞採用全新的3D懸浮式培養，提高細胞存活率與維持幹細胞活性，自然形成的球體更有利於後續幹細胞分化與各項實驗。

ABLE Bioreactor目前已被日本各大再生醫學研究機構應用於心肌細胞、胰臟（β細胞）、軟骨、腦神經、骨骼肌、肝臓、肺等之細胞分化。

因其由小至大的不同體積設計優勢，也廣泛應用於培養其他懸浮型細胞，如免疫細胞NK細胞、T細胞、B細胞等等。

★實際數據與比較：

A.在與傳統生物反應器的比較中，ABLE生物反應器(藍線)，具有更高增殖效率。[4]

B.針對四種體積之ABLE Bioreactor，在培養四天後，進行增殖率、球體尺寸與幹細胞活性之檢測。[5][6][7]

心肌研究實例：

• PLoS One. 2018 May 23;13(5):e0198026. Contractile force measurement of human induced pluripotent stem cell-derived cardiac cell sheet-tissue.

• Sci Rep.2016 Feb 18;6: 21747. TRPV-1-mediated elimination of residual iPS cells in bioengineered cardiac cell sheet tissues.

• Acta Biomater. 2016 Mar;33:110-21. Development of vascularized iPSC derived 3D-cardiomyocyte tissues by filtration Layer-by-Layer technique and their application for pharmaceutical assays.

結語

《Nature method》將類器官培育(Organoids)選為2017生命科學領域最具代表性年度技術[8]。於此同時，英國癌症研究中心(ICR) Nicola Valeri 教授也成功以類器官技術，體外培養出71位消化道癌症病人的衍生類器官(Patient-derived organoids，簡稱PDOs)，建立對有效藥物之預測準確率高達88%的 PDOs 平台，並將結果發表於《Science》[9]。「3D細胞培養」並非一項完全創新的技術，近年來由於動物發育學、細胞外基質及幹細胞培養等研究，將幹細胞及其衍生物的特性導入而發展出可模擬體內環境的細胞培養技術，提升實驗結果的真實性。

參考資料:

[1]Methods Mol Biol. 2016Sep01;1470:121-35. Three-Dimensional Spheroid Cell Culture Model for Target Identification Utilizing High-Throughput RNAi Screens.

[2]PLoS One. 2016 Sep 13;11(9):e0162394.A Novel High-Throughput 3D Screening System for EMT Inhibitors: A Pilot Screening Discovered the EMT Inhibitory Activity of CDK2 Inhibitor SU9516.

[3]AACR 103rd Annual Meeting 2012. 2012Mar 31‐Apr 4; Chicago.Establishment of Three DimensionalCancer Cell-CAF Co-Culture System

[4]ISSCR 2013 Annual meeting at Boston. 2013 June 12-15. The Development of Small ScaleSingle-UseBioreactor System for Human Induced Pluripotent Stem Cell.

[5]ISSCR 2017 Annual meeting at Boston. 2017 June 14-17. Evaluation of Small to Large Scale Bioreactor Series for IPS Cell Stirred Suspension Culture.

[6]Scale-Up and Manufacturing of Cell-Based Therapies V. 2017 Jan 16-19. The Development of Scalable Bioreactor Series for Human Induced Pluripotent Stem Cell Stirred Suspension Culture.

[7]ISSCR 2015 Annual meetingat Stockholm. 2015 June 24-27. The Scalable Bioreactor Series for Pluripotent Stem Cell Stirred Suspension Culture.

[8]Nature Methods. 2018; 15, 1

[9]Science. 2018 Feb 23; 359(6378): 920-926. Patient-Derived Organoids Model TreatmentResponse of Metastatic Gastrointestinal Cancers.

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