醫學研究部 定序核心團隊

　

Oxford Nanopore Technique(簡稱ONT)是一間主要發展長片段核酸定序之第三代測序技術的公司，在2012年時推出MinION系統(如圖1)，

圖 1

它以體積小(隨身碟般大小)及攜帶方便受矚目，重量不到100公克，目前定序長度最長可以到2Mb。相較其他定序平台，MinION有什麼優缺點呢?

1. 速度: 由於MinION的定序原理是利用電信訊號技術，一秒可以測250個核苷酸，定序速度是化學法定序的2萬倍。

2. 讀長: MinION讀長較長 (除了Direct Genomics)，節省拼接成本，為研究基因組的重複序列的利器。

3. 直接定序: 可直接對原始DNA樣本進行定序，避免PCR 擴增時出現的錯誤率及偏好性；此外還能直接測RNA的序列，降低reverse transcription時產生的誤差，並降低成本。

4. 錯誤率:不過相較於第二代定序（錯誤率低於1%），第三代定序技術目前的錯誤率還是比較高，大約在5%-10%，但是第三代定序的錯誤是完全隨機發生的，可以透過增加覆蓋度(coverage rate)來校正。

MinION系統的原理:

目前其他定序平台都是透過偵測第二介質(如光線、顏色或pH值的變動)來「間接」探測DNA的序列，而MinION系統則是利用連續的電流信號變化「直接」做序列偵測。ONT的核心技術是將多個人工合成的重組蛋白嵌入高度絶緣的電子晶片上並組成奈米孔洞 (如圖2)，當核苷酸通過奈米孔時，會產生電荷變化，從而短暫地影響流過奈米孔洞的電流強度（每種核苷酸所影響的電流變化幅度是不同的），藉由電流變化的差異分辨核苷酸種類，這種方法可以大幅增加測序速度。

圖 2

目前長片段定序的主要應用如下：

1.協助 de novo genome assembly

讀序愈長會使得DNA的組裝更加容易、DNA排序也更加準確，如同拼圖一般，愈大片愈容易拼湊完成。

2.長片段定序可以有跨越重複性較高的核酸序列

大部份的基因組均包含了大量的重複序列，例如transposons, satellites, gene duplications等，通常在短片段定序時會比較難以跨越因而導致完整序列拼裝困難。長片段定序可以可以減少序列併裝時的間隙，有效完成完整的基因組。

目前在全基因組定序針對高度重複性區域仍無法組裝的區域如:

a.Telomere

b. Centromere

c. Short-arm of acrocentric chromosome (chro 13, 14, 15, 21, 22, Y)

d. Large heterochromatic region (chro 1, 9, 16, Y)

3.協助DNA Structure Variation之解序

Structure variation涵蓋copy number variation (CNV), duplications, translocations and inversions (Table 1)。

Table1 Definition of Large Structure Variants

傳統定義來說超過1000bp的基因變化即為Structure variation，但近幾年隨著定序的解析度大幅提升，把這個定義限縮至50bp。而Structure variants是在自閉症、精神分裂症及癌症病人的基因上非常容易發現，通常短片段定序很難在一個讀序涵蓋整個Structure variation，而長片段定序可以協助釐清整個疾病基因之結構。例如乳癌BRCA1基因exon10 (NA12878)，總長3688bp就會包含三個deletion，一個duplication及一個point mutation；乳癌BRCA2基因exon11 (NA12878)，總長5101bp就會包含三個deletion及兩個point mutations；運動神經元存活基因SMN1 exon2-8 (NA12878)，總長16434bp包含兩個duplication及兩個point mutation；低密度脂蛋白受體(LDLR)缺陷exon 2-8 (NA12878)，總長11943bp，包含一個deletion及兩個duplication; LDLR缺陷exon 8-15 (NA12878)，總長12664bp，包含一個deletion及一個duplication。由於ONT的MinION在六個小時內可以得到2-3Gb的結果，因此在設計上可以將上述幾個因結構性改變的疾病基因pool在一起做多重基因檢測，可快速並有效率地得到檢測結果。

MinION系統輕便且快速的定序技術，讓我們往即時基因監測的藍圖邁向一大步，縱使目前錯誤率依然偏高，隨科技的進步，相信未來幾年一定可以降低到跟第二代NGS一樣的範圍。

參考網站:

https://nanoporetech.com/applications/dna-nanopore-sequencing

檢體萃取及次世代定序服務

蔡芷季 組長 院內分機65759

吳侑靜 博士 院內分機66680

劉怡里 小姐 院內分機65781

郭俊宏 先生 院內分機63271

陳家怡 小姐 院內分機63270

生物資訊分析服務

許家郎 博士 院內分機65989　

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