騰達行有限公司 張力云專員

　

幾十年以來，我們透過哺乳動物體外細胞培養了解體內細胞行為的機制，這些行為會受到其生物化學和生物力學微環境的影響，包括細胞分化、遷移、生長和力學等。而這些機制對於組織和器官形成以及其在體內的功能極為重要，也是研究人員持續致力探索和了解的方向。

過去研究者多採用二維（2D）細胞培養系統，使用經特殊表面處理如聚苯乙烯之培養錐形瓶和培養皿，進行貼附細胞培養，這種方法成為常規細胞培養系統的主流，用以研究細胞對生物物理和生物化學刺激的反應。但越來越多的證據顯示，在某些情況下，二維系統培養細胞之生物活性或表現明顯偏離在體內反應。例如，癌細胞的一些重要特徵無法在二維培養中適當地被表達出來。為了克服這些限制，多元化的3維（3D）細胞培養平台逐漸被研發出來，以提供更好地系統來模擬體內條件（如下圖）。在許多情況下，3D 培養的研究結果顯示，增加細胞外基質（ECM）可顯著影響細胞增殖、分化、細胞存活及行為表現。

Primary hepatocytes exhibit differentiated morphology on 3D growth substrate

▇ 進入三維的世界：3D 細胞培養

目前3D 細胞培養系統包含以下幾種：

[1] 微載體 Microcarrier

1967 年，Van Wezel 發現微載體可支持貼附型細胞的生長，微載體的開發就此開始。微載體為 125-250 微米球體，常於生物製劑（蛋白質）和疫苗的大規模商業生產中，用來生產蛋白質或產生病毒。由於其密度之特性，它們可以在溫和攪拌下於旋轉瓶保持懸浮狀態，以進行細胞培養。微載體可以由許多不同的材料製成，包括 DEAE－葡聚醣、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、膠原蛋白和藻酸鹽等等，然而不同的材料以及不同的表面化學物質，如細胞外基質蛋白、重組蛋白、肽和正電荷或負電荷的分子等，皆可能造成細胞行為不同，包括細胞的形態和增殖。雖然其具易於放大及可減少培養箱空間使用的優勢，但仍舊與 2D 培養方式相似，皆只能以單層方式貼附在支撐表面上，因此型態和表現上仍與實際表現不同。

[2] 球體培養 Spheroid Cultures

細胞球體培養是簡單的 3D 培養方式，可用於多數細胞類型，主要是利用貼附型細胞在受到阻礙無法與培養物黏附的情況下，具有聚集和形成球狀體的自然趨勢，使細胞形成球體。常見的細胞包括胚狀體、球狀球體、腫瘤球狀體、肝球體和神經球體。其常使用無基質方法，包括使用低細胞黏培養表面，例如 Corning® Ultra-Low 超低附著表面，或將細胞懸浮培養在培養基中，例如懸滴技術、旋轉培養和生物反應器。球體培養出之細胞能有效地擴散氧氣和營養物質以及去除代謝廢物，且可通過光學、螢光和共焦顯微鏡進行成像，進而輕鬆分析球體，這是比較複雜的 3D 細胞培養模型的優勢。因此球體培養比 2D 環境更能有效地模擬無血管的實體腫瘤行為以及多能幹細胞（PSCs）的分化。然而球體培養的整體尺寸必須限制在幾百微米，若超過此範圍，球體的核心內會發生壞死，因此在培養上也多有限制。

[3] 水凝膠 3D Cultures using Hydrogels and Extracellular Matrices

另一種方法是，透過結構特殊之細胞培養材質來模仿體內細胞生長之細胞骨架（scaffold），提供細胞生長空間，使其不只貼附於表面，更能四面八方與其他細胞或是細胞外間質做聯繫，展現活體組織的型態。

水凝膠由聚合物鍊或者天然或合成來源的複雜蛋白質分子組成，由於其含水量大，因此具有與組織非常相似的生物物理學特性，可作為 3D 細胞培養的基質。水凝膠可以獨立使用建構 3D 矩陣，也可以與其他技術結合使用，如固體支架、可滲透支撐、細胞微陣列和微流體裝置等等。

目前廣泛使用的Matrigel是一種天然水凝膠的商業產品，可用於體外和體內 3D 細胞培養，其來自於 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ，小鼠肉瘤組織，能提供大量基質蛋白，而主要成分為 Laminin，其次為 Collagen IV、Heparan Sulfate Proteoglycan、Entacin和Nidogen。此外，EHS 本身也含有生長因子，如 TGF-Beta、Fibroblast Growth Factor 和 Tissue Plasminogen activator 等。Matrigel 含有豐富的基質蛋白和生長因子，對於正常或是經過轉型（Transformed）的貼附型細胞都能提供絕佳貼附或分化的生長平台，經測試過的細胞包括 Neurons、Oligodendrocytes、Hapatocytes、Sertoli cells、Chick lens、Melanoma cells、Vascular endothelial cells、Thyroid cells和Hair follicle cells，並且主要應用在腫瘤細胞侵襲實驗（Tumor cell invasion assay）、周邊神經再生實驗以及血管新生等方面的研究。

Type I 型膠原蛋白是另一種常用的 3D 細胞培養天然水凝膠。膠原 Type I 是在基質隔室和骨中發現的常見 ECM 分子。它可以從各種生物資源中分離出來，包括牛皮、鼠尾肌腱和人胎盤。現已有商品化的第一型膠原蛋白 (Collagen Type I) 和生物相容性之吸收棉，形成緊密 3D 結構，創造如同在生物體內之細胞生長環境，讓細胞表現更接近真實狀態。

The morphology and the growth pattern of bronchial smooth muscle cells appeared to be influenced by the RAFT 3D cell culture system.

　

　
Data Courtesy of Magdeldin et. al, 2014, J Tissue Eng

[4] 微流體培養 Microfluidics

微流體培養系統是將小至幾個微升（microliter；10^-6 liter）、奈升（nanoliter；10^-9 liter）、甚至皮升（picoliter；10^-12 liter）體積的流體，導入佈滿毛細管道（連續型）或載體（非連續型）的晶片中，以機械式或光學式的幫浦，讓流體在微管道中執行混合、分離、過濾、培養、檢測反應等各種流程。其關鍵組成部分是能夠模擬細胞微環境，包括調節細胞結構、功能、行為和生長等因子。而另外重要的部分是能夠提供與生物體內相同之穩定梯度，因為這些梯度對細胞的趨化性、趨向性和觸覺等效應方面有著的重要作用。

微流體細胞培養的優點包括可減少樣品體積以及可在同一裝置內設定多個微環境指數，與傳統培養系統（如 flask、dish 和 culture plate）相比，針對某些細胞群，更容易在少量細胞狀況下研究其細胞間的相互作用，也更容易研究不會分裂或分裂速度慢的細胞（如幹細胞）。而由於微流體的尺寸很小，可以更輕易地實現層流，以及準確地模擬體內流體動力學，並且在不影響其他培養室的情況下完成培養系統的操作。

目前有商業產品附帶有即時細胞影像觀察平台，並結合了微流體與細胞培養之技術，提供細胞接近人體組織之生存環境。此微流體系統可透過特有的微流體板使細胞暴露於不同的培養條件，再利用加壓空氣將欲注入之培養液、藥物或其他物質透過不同的分支管線注入細胞樣品 well 中，此外細胞樣品槽中具有如同細胞膜孔的設計，可模擬物質從血管中透過擴散方式進入細胞內的模式。其分支管線之間為真空密封，所以可確保每個 well 獨立運作，並隨實驗條件準確切換流速和流體。此外可搭配倒立式顯微鏡做連續性監控活細胞影像，讓被監控的活細胞對溫度、氣體、藥物等環境變化反應變的容易單純。

微流體系統配置

細胞樣本培養槽設計

　

1 Inlet for gravity drien continuous perfusion
2~5 Independent flow inlets for pressure driven flow
6 Inlet for cell loading
7~8 Outlets to waste wells

A .每個chamber 總細胞量及每個細胞經GADPH normalized後 EGFR 之表現量
B. MCF-10A 培養於dish 及 CellASIC ONIX 細胞 EGFR表現量差異之比較   
　

微流體系統目前已應用於優化細胞培養條件、觀察宿主與病原體間的交互作用，以及細胞藥物反應監測等。

　

▇ 微流體系統平台應用範例：酵母菌衰老的研究

酵母菌出芽生殖為不對稱的分裂，較小的子細胞會從較大的母細胞分裂而出，雖然子細胞系譜是不朽的，但母細胞會隨著每次的分裂逐漸衰老而死亡。酵母菌母體可以做為研究人類老化的模型，為了研究 Saccharomyces cerevisiae 酵母菌其母體細胞老化的狀況，研究團隊結合商業化微流體平台和遺傳分析工具，用來抑制酵母菌子細胞的增生、監測酵母菌蛋白及分布的變化，並觀察其和老化的關聯性。

(a)使用 CellASIC 微流體系統可以長時間監測四種菌株（A-D）。將細胞注入培養室 60 分鐘後灌注培養基，並且用雌二醇灌注培養基活化 34 小時。加入雌二醇後，只有 母細胞群聚(mother enrichment program; MEP) 菌株的子細胞在有絲分裂中停滯，子細胞無法增殖而母細胞繼續分裂。
(b)顯微鏡下顯示來自創始母細胞的菌落生長（紅色框線）。比例尺：5 μm。

研究中觀察酵母菌細胞老化蛋白分佈變化，是透過延時攝影顯微鏡分析 MEP 細胞不同蛋白 Sir2-GFP（a）、Hsp104-GFP（b）、Hsp42-GFP（c）或 Om45-GFP（d）的表現，並使用 Nup49-mCherry 作為核周邊的標記。上下兩區影像來自同一拍攝群，拍攝時間間隔 20∼60 分鐘，可顯示酵母菌出芽分裂老化的改變。對於 Sir2-GFP 的表現，六種酵母菌細胞皆顯示相同的老化表型。而對於 Hsp104-GFP、Hsp42-GFP和Om45-GFP，分別有 14 個中的 10 個、10 個中的 7 個和 13 個細胞中的 11 個，顯示和figure 2類似的老化現象。

▇ 結語

微流體系統是檢測酵母菌增生老化非常有效的工具，這種方法可以監測多代的細胞狀況，其中最新設計可以同時分析多種菌株或條件。重要的是，可利用螢光標記物觀察單細胞水平的整個壽命期間。現有市面上微流體系統的一大缺點是它們的使用通常需要特殊的訓練和設備，而且在實驗室中不容易建立。相比之下，本文中所介紹的微流體系統較易取得與操作 (參閱後附參考資料)，也能夠連接到任何倒置顯微鏡，系統中的子細胞不會被培養基流除去，並且可以與它們的母細胞一起分析。值得注意的是，目前研究酵母複製老化而開發的大多數微流體系統僅與單倍體細胞相容，而本微流體 系統適用於單倍體和二倍體細胞，可說是相當便利。

Ref :

Microb Cell. 2017 May 1; 4(5): 169–174. A simple microfluidic platform to study age-dependent protein abundance and localization changes in Saccharomyces cerevisiae

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