醫學研究部 許家郎專案助理研究員 

次世代定序技術(Next-generation sequencing，簡稱NGS)的發展與問世，為基因體學研究，帶來革命性的影響。所謂「次世代」定序，是泛指有別於Sanger定序的方法，並具有通量高、速度快、與費用低等優勢。而利用不同的分子生物學與物理化學技術，將序列片段分離出來與建庫(library)，再利用定序技術來辨識這些片段的核酸組成，就延伸出各種”-Seq”的資料，例如RNA-seq就是將RNA片段定序的研究技術，而exome-seq就是將基因組內exon的部分擷取出來並定序的技術，另外還有許多研究epigenomics的實驗方法，包括ChIP-seq、ATAC-seq、HiC-seq等等。這一期，將著重在NGS技術在轉錄體的應用，特別是RNA-seq。

如前所提，RNA-seq就是將RNA片段定序的研究方法。利用定序技術來研究轉錄體並非全新的概念，在Sanger定序的時代，就有將所有RNA片段建庫與定序的研究方法，例如EST(Expression Sequence Tag)與SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)，成功的應用在許多基因體計畫上，特別是在未知基因(novel gene)探索上。但是，Sanger定序的主要缺點，就是通量(throughput)低與速度慢，因此應用的範圍有限；而NGS高通量的特點，造就NGS可以成功的廣泛地應用於轉錄體研究上。由於建庫與定序是一種「隨機」抽樣的過程，無法確保每一個片段都可以成功定序出來。再加上，基因表現有高有低，高表現的基因，會有大量的RNA片段，因此在定序過程中，有較高的機率被抽中；反之，低表現的基因，由於RNA片段量少，因此被抽中的機率相對低。為了讓低表現的RNA有機會被抽中，那就必須增加抽樣的次數，也就是提高通量。藉由通量的提高，不但可涵蓋完整的RAN資訊，也可獲得準確的量化資料。

RNA-seq除了可用於量測基因表現量外，還可從RNA-seq資料獲取其他基因體或轉錄體資訊。在NGS技術中，我們把定序儀(sequencer)產出的序列片段，稱作read。藉由分析RNA-seq read，可取得的資訊與應用，詳列如下(圖1)：

  


圖1、RNA-seq資料能取得的資訊。

￭ Gene expression

這是RNA-seq最廣為人知的應用項目，概念是基因轉錄出來的RNA片段，與定序儀產出的read數成正比，因此可將來自於某基因序列數量(read count)，來代表該基因的表現量。

￭ Gene discovery

在基因體上，能夠被轉錄出來的區域，就能稱作廣義的「基因」。如果RNA-seq read比對到基因體參考序列(reference sequence)的區域，是從未註解過，則該區域將可能是新的基因區域(locus)。例如，lncRNA (long non-coding RNA)是一種與mRNA結構類似，但卻不具有轉譯出蛋白質能力的RNA。由於NGS的發展，有大量的lncRNA被發現。另外，如果研究的物種缺乏參考序列，也可以利用RNA-seq的方式來尋找具功能性的基因。

￭ Alternative transcript discovery and quantification

在真核生物中，由於基因剪接(alternative splicing)機制，一個基因能產生一種形式以上的轉錄本(transcript)。可以藉由分析read是否橫跨不同的外顯子(exon)組合，來推論是否有新的轉錄本；同理，也可以藉由不同轉錄本上的read個數，來量化其不同轉錄本的表現量。

￭ Gene fusion discovery

概念類似alternative transcripts，如果read有部分屬於A基因，另一部分屬於B基因，代表兩基因有fusion的可能性。雖然fusion主要是在基因體結構異常造成的，但是如果能發現其轉錄本，代表此fusion gene是具有功能性。

￭ Gene variant identification

由於RNA是以基因體為模板所抄錄出來的，因此read上也帶有基因體資訊。當我們把read與參考序列做比對，就可以尋找出可能的變異點(variants)。然而，在轉錄過程中，RNA上的特定位置會受到編輯(editing)，因此如何區分是RNA editing還是DNA variant，是後續資料分析中，需注意的地方。

￭ Allele-specific expression

我們成對的體染色體中，一套來自於父親(paternal)，另一套來自於母親(maternal)，大部分的基因在兩套染色體中都會表現，但有少數的基因只會由某一套來表現，例如印痕基因(imprinted genes)。由於read上帶有基因變異點的資訊，如果該變異點是heterozygous，則可以藉由計算不同allele的read個數，來推論是否為allele-specific expressed gene。

然而，並非所有的RNA-seq資料都可以獲取這些資訊。依據建庫的方法，RNA-seq還可以分做whole transcriptome sequencing (WTS)與mRNA-seq。WTS通常除了rRNA外，其他RNA類型都可偵測到，包含mRNA與lncRNA；然而，mRNA-seq顧名思義，是針對mRNA做定序，因此在建庫前，先利用分子生物學方法，將mRNA序列抓取出來，最廣泛使用的策略，是利用探針(probe)針對mRNA 3’端的poly-A序列，將mRNA抓取下來。從這兩種建庫的方法，可以想像能獲取的資訊就有很大的差異：前者可以觀測大部分的RNA，但後者只能觀測mRNA。除建庫的方法不同會影響所得的資訊外，NGS實驗還牽涉到許多參數，不同的參數選擇也會影響所得的資訊範圍與準確性。

￭ 序列長度(read length)

定序儀藉由設定cycle數，來決定序列長度。序列長度有幾個主要考量：首先，在資料分析上，會把read與參考序列做比對，如果read太短，容易產生單一read對應到多個區域(multiple-hits)。另外，在真核細胞中，由於有基因剪接的機制，如果read剛好橫跨不同外顯子(exon)的序列，在比對過程中，會把read切成兩段，才有辦法成功比對到參考序列上。當read切成兩段後，如果有一段片段太短時，將無法正確的對應到參考序列上。目前市面上常見的定序儀，長度都能夠達到50鹼基對(base pair)以上，因此比對時發生對應至多區域的機率，將大大降低。如果研究目的只是要量測基因表現量(gene expression profiling)，序列長度50-75 bp就足夠；但如果是想尋找alternative splicing或者gene fusion這結構變化時，建議使用更長的序列長度。

￭ 單端(single-end)與雙端(pair-end)序列

Single-end指只針對RNA片段一端定序，而pair-end指對RNA片段兩端定序，大部分的定序儀都能提供這兩種定序模式。在RNA-seq中，single-end就足以提供各種資訊，但如果研究目的是要尋找基因剪接或gene fusion，那建議使用pair-end。如果一組pair-end read，一端坐落在某個外顯子或基因上，一端坐落在另一個外顯子或基因上時，這種資訊將提高尋找基因剪接或gene fusion的可信度。

￭ 序列深度(read depth)

在RNA-seq中，所探討的序列深度指的是：需要有多少read產出，才能提供足夠的資訊。序列深度，取決於RNA-seq實驗的目的。例如，WTS和mRNA-seq，前者就需要後者較大的深度，因為前者涵蓋的RNA種類與數量大於後者。如果同樣是WTS，但單純量測基因表現量，與想研究基因剪接或尋找fusion gene時，後者就需比前者更大的深度。一般來說mRNA-seq實驗，建議至少能達到1千萬條序列(10 million reads)，而WTS至少要5千萬條序列。

NGS技術逐漸普及，價格也逐漸降低，不再是高不可攀的研究方法。但執行前，要釐清研究目的，並選擇正確的平台與參數，才能夠獲取有用的結果。醫學研究部新增了次世代基因定序與生物資訊分析服務，如有研究上的需要，歡迎與我們聯絡。

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許家郎博士 分機: 65989
 
延伸閱讀：

Byron S.A. et al. Nature Review Genetics, 2016; 17:257-271

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