騰達行公司 江明珊專員 

一.前言

流式細胞儀不論是在學術研究或臨床診斷上，已是不可或缺的偵測工具。簡單來說，流式細胞儀的分析技術是將標定螢光的細胞(或顆粒)經過雷射激發後，將所產生的光學訊號經過電子系統轉換後，最後由電腦分析成數據。早在2003年，Nature Medicine就曾指出多色螢光實驗必將成為流式技術發展的趨勢，尤其在免疫學研究中，為了區分不同功能的細胞族群，需要同時標記多種抗原，然而多參數相當於多螢光，傳統的螢光染劑種類已不敷使用。

二.高亮度螢光抗體-BD Horizon Brilliant™

除了品質優良的儀器外，螢光抗體的選擇在流式技術上亦是相當重要的一環。為了符合多參數多螢光的研究趨勢，BD Biosciences利用獨特的聚合物染劑技術(polymer dyes technology)發展出Horizon Brilliant™系列螢光抗體，這樣的技術使螢光染劑亮度提高且對光更穩定，依照不同雷射激發，螢光染劑可分為Brilliant Blue、Brilliant Violet和Brilliant UV染劑 (簡稱BB, BV, BUV) (表一)。這系列的螢光染劑的高亮度特性，可以讓抗原表現量較少的細胞族群更容易被偵測到 (圖一)。而且，傳統螢光染劑 (例如: FITC、PE等)大都以藍光或紅光雷射激發，若能彈性地搭配紫光 (Violet laser)或UV雷射激發的螢光染劑，便能減少螢光染劑之間的干擾，提高數據解析度，例如由UV雷射激發的BUV395，和大多數的螢光染劑沒有干擾(表二)，在螢光搭配上，BUV395便是相當好的選擇。

三.螢光的選擇及搭配

在選擇螢光染劑之前，一定要先知道所使用的流式細胞儀規格，像是第三共研和第八共研的BD FACSVerse™，規格為藍光雷射 (blue laser)，4個螢光通道; 紅光雷射 (red laser)，2個螢光通道，所以，是一台兩支雷射，最多可以做6色的儀器(表三)。此外，第三共研亦提供BD LSRII機型，規格為藍光雷射 (blue laser)，4個螢光通道；紅光雷射 (red laser)，3個螢光通道；紫光雷射 (violet laser)，5個螢光通道；UV雷射 (UV laser)，2個螢光通道，所以，是一台四支雷射，最多可以做14色的儀器(表四)。螢光染劑的特性需與實驗内容相輔相成，才能搭配出適合的螢光組合。簡單來說，螢光的選擇可以有幾個重點:

1. 根據儀器規格，找出可用的螢光染劑。

2. 螢光亮度的強弱分類：弱表達marker搭配強亮度螢光 (表五)。

3. 螢光間干擾最小化(Minimize spillover)。

4. 盡量避免Tandem dye帶來的偽陽性。

另外，還可以透過螢光光譜，知道各螢光散射光(emission)波長間重疊(干擾)的狀況 (圖二)。

四.廠商資源

最後，也可以多加利用原廠資源來協助多色螢光平台的建立喔!

BD Biosciences Multicolor Tool:

1. 螢光光譜 (Spectrum Viewer): http://www.bdbiosciences.com/us/s/spectrumviewer

2. 螢光配色平台建立 (BD Horizon™ Guided Panel Solution):http://www.bdbiosciences.com/us/s/gps/

3. 多色螢光資源: http://www.bdbiosciences.com/colors

圖表:

表一: Horizon Brilliant™系列螢光染劑-BB, BV, BUV染劑

圖一.高亮度螢光染劑使弱表達的markrer訊號放大: 以同螢光CD3搭配不同螢 光亮度的CD197螢光抗體，高亮度的螢光抗體可讓CD197⁺細胞族群有更好的解析度。上排為中、高度螢光，下排為中、弱亮度螢光。

表二. BUV395漏光至其他channel 的程度 (%spillover): BUV395 幾乎不會漏光到其它螢光channel，非常適合用於多色染色的實驗，也能減少檢體及抗體使用量。

表三. BD FACSVerse™規格

表四. BD LSRII規格

表五. 螢光亮度相對表

圖二: 各雷射激發的螢光光譜。

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