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DNA合成時，DNA聚合酶(DNA polymerase)將相對應之去氧核糖核苷酸（dNTP）結合至新合成股3’端，接著釋放出PPi，PPi在ATP硫酸化酶(ATP Sulfurylase)作用下，將adenosine phosphosulfate（APS）轉換成adenosine triphosphate（ATP），而ATP 可提供能量使螢光素 (luciferin) 產生冷光，此冷光強度與ATP濃度成正比，隨後所有反應物經雙磷酸酶 (Apyrase) 作用完成降解。藉由依序加入4 種不同的去氧核醣核苷酸，偵測反應時冷光激發與否及強度，即可得出相對應的DNA 序列。其實驗步驟如下圖。

相較於傳統的Sanger定序法，焦磷酸定序不需要進行電泳及螢光標記，而且實驗流程快速 (包含 PCR僅需3小時即可得到結果)， 靈敏度高 (約5%)。但Sanger定序法一段讀長約1000bp，焦磷酸定序受限於酵素活性與反應特性，精準讀長約為100-200bp。

焦磷酸定序目前主要用於單點突變（SNP）與基因甲基化（methylation）的研究。前者可針對已發現的SNP研究，包含SNP頻率分析及SNP位點的核苷酸種類確認，研究者需要將特定SNP所在之DNA片段經PCR放大後進行焦磷酸定序，藉由比較不同核苷酸訊號高度即可瞭解SNP頻率，並依據相關病症或表現進行後續研究。如果是要確認SNP位點的核苷酸種類，首先經PCR放大得到特定SNP所在的DNA片段，然後在SNP位點的上、下游設計測序引子，這樣便可透過對十幾個核苷酸序列的測定，確定SNP位點的核苷酸種類以及SNP位點上下游十幾個核苷酸的序列，可藉此確認菌種或是否帶有抗藥性基因。

DNA 甲基化是透過三種DNA甲基化轉移酶 (DNMT1、DNMT3a與DNMT3b) 將一個甲基 (-CH₃) 以共價鍵結的方式加到胞嘧啶 (cytosine) 上，形成 5-甲基化胞嘧啶 (5-methylcytosine) 的結果，此種甲基化的過程主要發生於真核細胞的 DNA，而甲基化的胞嘧啶通常會發生於胞嘧啶與鳥糞嘌呤 (guanine) 相鄰的序列上，即 CpG site (5´-CpG-3´)。甲基化並沒有改變 DNA 序列，卻可以調控基因表現，在細胞中基因調控區CpG island的甲基化，可讓其下游基因處於關閉狀態，已有許多研究顯示甲基化狀態的改變與疾病產生有關聯性。利用焦磷酸定序能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，藉以了解哪些DNA序列位點發生甲基化，每個位點的甲基化程度是多少，以及這些位點的甲基化和疾病的相關性，提供表觀基因學（epigenetics）研究重要的訊息。

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