醫學研究部(Department
of Medical Research)共 同 研 究 室 電 子 報
第四十期 APR.10.2017
本期目錄
下期主題
動態培養系統
快速連結
清明時節天氣好！看個電子報也不錯！本期電子報主要針對近紅外光影像分析儀如何取代傳統Western blot的原理與應用進行介紹。下期電子報將介紹全自動二維/三維動態培養系統的應用--人體微環境中的機械力對於細胞的作用，敬請密切注意。並竭誠歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器介紹、研究新知、與每月訓練課程資訊。更歡迎您與我們聯絡，給予我們建議與鼓勵。
共同研究室公用儀器服務—流式細胞儀(BD
FACSVerse)、冷凍切片機及石蠟切片機之網路預約系統將於四月十三日起正式開放，儀器介紹與預約規定請見預約網頁。歡迎儀器使用者至共同研究室核心設施暨共用儀器預約系統申請帳號，儀器管理人審核資格通過後，即可開始預約。敬請舊雨新知多多利用!本月份「臺大醫學校區學術演講及研討會公告平台」將公告多場精彩演講及課程，歡迎同仁查詢使用，並踴躍申請帳號發佈訊息。希望我們所提供的設備對您的研究有所助益，服務品質也令您滿意，為了共研長期的經營運作，請您於發表文章時惠予致謝共同研究室，作為服務成效評鑑之用。
TOP
以近紅外光螢光方式偵測Western blot訊號增進實驗數據可再現性及正確性(Make More Discoveries With Near-Infrared Fluorescence Imaging)
騰達行公司 吳美萱小姐
傳統Western blot呈色的方法，是利用HRP酵素標示二級抗體與受質作用後，使其發出化學冷光，再以底片感光或CCD 相機偵測化學冷光。此方法方便性高，但存在其限制問題：(1) 生物學研究趨向於多色分析 (Multiplex Detection)，化學冷光法仍是單色單目標分析方式，無法同時進行定量標準化或比較性分析。(2) 酵素-受質反應屬動態狀態，其結果受反應時間與酵素受質的品質等因素影響很大，且需要反覆試驗尋求最適當的曝光時間。因此利用可見光螢光標識二級抗體偵測 Western 的方式也應運而生，抗體直接標識螢光物質，而無酵素作用的不確定性因素，則可以增加定量線性範圍及準確度。
圖一、訊號定量線性度比較：NIR螢光影像儀偵測
vs
化學冷光/底片偵測
資料來源: Wang, Y. V., Wade, M., Wong, E., Li, Y.-C., Rodewald, L. W., & Wahl, G. M. (2007). Quantitative analyses reveal the importance of regulated Hdmx degradation for P53 activation. PNAS , 12365-12370
一般視野可辨識的可見光波長範圍泛指 400 ~ 700nm 波長範圍，常見的螢光物質包括Cy3、Cy5、FITC等，以及螢光蛋白如GFP。目前儘管已廣泛應用，但是在部分研究方面如Western blot及活體實驗，還是無法提供最好的結果。因為生物物質 (細胞、組織) 或化學合成物質 (實驗塑材、漬膜) 等，於可見光範圍會產生自體螢光並對於光線散射度高，因此導致背景值過高，使可見光螢光偵測的靈敏度受限，無法有效應用於定量蛋白的差異表現。
近紅外光螢光(NIR) 波長位於700-800nm範圍，相較於一般可見光螢光，NIR波長範圍明顯降低來自實驗材料自生性螢光的干擾，有效減低肇因於自生性螢光造成的背景與光散射的問題, 背景螢光影響最低，因此可得到最佳的信噪比值 (Signal-to-noise ratio)，相對即可提升實驗的靈敏（圖二）。
圖二.
IR fluorescence detection outperforms visible fluorescence.
近紅外光螢光影像系統具備雙色雷射光源，即可以在同一張blot上同時偵測兩種不同之標的蛋白(圖三)，例如磷酸化研究需偵測Interesting phosphorylation protein的磷酸化之量，同時偵測Total protein之量，作為標準化不同檢體之間的總蛋白質量，即可在同一張blot上得知蛋白質磷酸化程度，以此優點可應用在細胞內訊息傳遞研究，並且省去 Stripping、Re-probe、受質呈色、底片曝光等繁瑣的實驗步驟。
圖三、Time
course of JNK phosphorylation, in response to LPS treatment.
Phospho-JNK is shown in green, total JNK in red. Yellow
indicates overlapping signals. Reprinted with permission from
Bond, D. et al. Biol. Proced. Online 10(1): 20-28 (2008).
雙近紅外光螢光影像系統，可偵測螢光標示之 western blot 與一般電泳膠片，也可偵測多孔反應盤與細胞培養盤，兼具 Imager 與 plate reader 功能。同時可以偵測螢光免疫染色之組織切片，分析 Protein Array。是為多功能的細胞蛋白質表現研究工具。
此近紅外光影像分析儀已購置於第三共研，第一次上機前請先與第三共研歐陽小姐聯繫，以提供相關研究諮詢。分機65725 。
儀器訓練課程:課程網路報名
| 04月18日 |
生物能量代謝測定儀(Seahorse XFe 24 Analyzer)
|
研究新知課程/學術演講:課程網路報名
| 04月25日 |
Single Cell Analysis (from Single
Cell Isolation to NGS)
|
|
| 05月08日 | 代謝體學的應用與單株抗體晶片篩選生物標記 |
歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器訓練與研究新知課程講習相關資訊 。