醫學研究部共同研究室

大家好，本期共同研究室電子報所要介紹的主題為「自由基測定儀」之基本原理與應用。越來越多的研究顯示，自由基與身體許多疾病相關，過多的自由基會給組織細胞帶來氧化壓力，破壞細胞膜、蛋白質及基因，將導致身體出現功能不良、慢性疾病(癌症)、老化或死亡。目前第三共同研究室設有兩台並有專人提供相關技術服務，期望能提供各位同仁所需之研究支援。此外，本期電子報的研究新知為肥胖與氣喘之間的關連-先天性免疫細胞扮演了關鍵性的角色，相信能為同仁帶來新的研究想法。另外有一個好消息要告訴大家，醫研部新增一台「高速四向流式分選儀」，由莊雅婷助理研究員統籌，目前正在測試儀器功能並且建構網路預約系統中，預計將於四月開放網路預約委託服務，敬請注意公告並且歡迎同仁踴躍預約使用!

第二共同研究室顯微影像分析工作站，因電腦不堪負荷，將於103年3月24日進行維護，屆時會清除使用者暫存於工作站電腦中之資料。尚未存出資料的使用者儘速於3月24日前存回各自資料。共同研究室顯微鏡室日後將會不定期清理工作站電腦暫存之資料，請使用者於使用分析後自行保存各項資料，共同研究室不負資料保存管理之責。如有問題，請洽第二共同研究室孫小姐(分機63206)。下期主題為顯微影像服務系統將說明包含原理、應用與申請使用方法，歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取相關訊息，更歡迎您與我們聯絡，給我們鼓勵與建議。

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一、何謂自由基

自由基(free radical)是指能獨立存在，含有一個或一個以上不成對電子的任何元子或原子團。生物體內所產生的自由基主要是氧自由基 (不配對電子位於氧) 又稱活性氧分子（reactive oxygen species；ROS），如O₂^‧-(或HO₂^‧)與‧OH或及其活性衍生物如H₂O₂、RO‧、ROOH等。

在正常狀態下的生物體內氧自由基產生與清除是處於動態平衡的，生物體也是可以利用氧自由基，例如一氧化氮•NO人體中樞神經系統傳遞訊息的因子，可促使血管舒張；另在細菌、病毒等侵入時，體內的防禦系統會促使吞噬細胞進行吞噬作用，透過吞噬體而進行酵素的催化，產生超氧陰離子自由基，用以清除細菌或受感染細胞。

但是當生物體因異常環境的影響而使自由基產生與清除失去平衡態，產生自由基連鎖反應而大量產生時，則會造成細胞中脂質過氧化而影響細胞膜功能受損、蛋白酶失去活性或破壞核酸及染色體斷裂等，促使細胞凋亡(Apoptosis)。自由基大量產生對人體造成的傷害不勝枚舉，最明顯的就是慢性疾病，包括心臟病、糖尿病、腸胃炎或潰瘍、腎小球腎炎、肺氣腫、癌症、免疫系統失調、中風…等。據估計，大約有一百多種疾病與自由基的過多而造成細胞結構及功能破壞有關，促使疾病的發生與發展。

(二)儀器簡介：

目前醫學研究部第三共同研究室設有兩台自由基測定儀，並且有專人提供技術服務。儀器的基本的介紹及使用收費細節如下:

CLD-110 CLA-FSL
A.儀器機型:
1.廠牌:Tohoku Electronic Industrial Co.,Ltd
型號 CLD-110:主要用於偵測活體自由基，但仍能更換式樣室來偵測
離體樣本。
2.廠牌:Tohoku Electronic Industrial Co., Ltd
型號 CLA-FSL: 本儀器有分光功能，可偵測範圍為330nm–700nm,共有20個偵測波段,每一波段間隔為20nm，主要用於偵測離體樣本，必要時可更換活體式樣室來偵測活體自由基。

B.自由基測定儀主機：
1.偵測波長範圍：300-650nm(型號CLA-FSL至700nm)。
2.偵測敏感度：200光子/cm²/s。
3.冷卻系統：
主要冷卻系統：Peltier Electronic Cooling
次要冷卻系統：Water Chiller 。
4.計數器：具有單一光子計數功能的光電倍增管
(Single Photon Counting with photomutiplier tube)。
5.最高使用溫度: 100℃。

C.控制及數據擷取軟體(CLA-DASH)
1.測量功能：設定測量參數、溫度設定、開始測量、暫停測量、停止測量、儲存數據等功能。
2.數據分析功能：圖形處理功能、數據比較功能、數據計算功能、數據列印功能。

D.液體專用試樣室
1.電子式加熱器：固定在樣品座下方，最高溫度可達100℃。
2.試劑注射孔：1個，位於試樣室正面。
3.攪拌功能：內建磁石攪拌器及控制器，可控制磁石轉速。
4.氣體進出孔：氣體入口 (inlet) 及出口(outlet)孔皆位於試樣室正面。

E.活體專用試樣室:1.適用於mice、rat等小動物。

三.儀器功能與偵測原理:利用化合物(外加之反應試劑)與自由基產生化學反應，激發至高能階狀態(自由基狀態)，當化合物從高能階狀態回到低能階狀態(穩定狀態)時，由於能量的轉移，使得化合物以光的方式釋放能量，因而產生光子。本儀器以能偵測到10^-15~10^-17w/cm2/sec能量(相當於200個光子的光量)的高感度光電倍增管(Photomultiplier Tube)來測定這些光子數，因為其靈敏度極佳，非常適合偵測樣本中自由基的數量。

四.開發之應用

1.可分析各種型態的試樣(固體、粉末、液體、薄膜…等等)。
2.可測量從生物體取出之全血、血漿、體液、組織、細胞或活體(小動物)體內各項器官中自由基的產量。
3.各類抗自由基產品的臨床研究。
4.早期偵測人體細胞受到自由基的傷害情形。
5.抗老化食品的研究。
6.功能性及健康食品的研究。

五.使用之收費項目

項目	儀器耗材費	儀器使用費(技術費)	備註
離體檢體或小動物活體之自由基檢測(自行操作)	100元/次	無
離體檢體之自由基檢測(委託操作)	100元/每一檢測試劑	1000元/次	檢測試劑有 Luminol:用以檢測total ROS Lucigenine:用以檢測superoxide
小動物活體自由基之檢測(委託操作)	500元/每一小動物	1500元/次	檢測試劑為 MCLA

計次單位 : 每三小時計一次。

本儀器經參加講習後可自行操作。

六.負責自由基測定儀操作服務的技術人員為蔡靜儀小姐，分機 65725，電子信箱 ci65725@gmail.com，若有任何問題，歡迎來電或來信討論。

七、本部不定期舉辦教學訓練課程，歡迎訂閱共研電子報以收取相關訊息，即時報名上課。部份課程備有教學影片，若有需要請洽儀器負責人。

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科學新知

肥胖與氣喘之間的關連: 先天性免疫細胞扮演了關鍵性的角色

醫學研究部莊雅婷博士

「肥胖」與「氣喘」間的關連，一直是近十幾年來熱門的研究主題，越來越多的研究報告指出:肥胖會增加氣喘的盛行及發生率，也會惡化氣喘的控制。肥胖的人比正常人得到氣喘病的機率高出三倍，在動物實驗的研究結果也顯示: 肥胖的老鼠先天有呼吸道的過度反應( airway hyperreactivity; AHR)，這種呼吸道過度反應是一種氣喘的主要典型特徵。同時，對卵白蛋白 (ovalbumin)敏感的肥胖老鼠也比正常體型的老鼠對卵白蛋白誘發之呼吸道過敏有較大的反應。這些發現都再再地支持了肥胖與氣喘的關係。然而，對於肥胖與氣喘相關的機轉基礎，至今仍是一個謎團，由於傳統的氣喘治療模式對肥胖者氣喘的療效不彰，因此了解更多肥胖與氣喘機相關的機轉基礎，成為針對肥胖型氣喘患者發展新療法的重要課題。

在今年一月的「自然醫學期刊 (Nature Medicine)」中，波士頓兒童醫院過敏與免疫科專科醫師，同時也是哈佛醫學院免疫學教授的梅津戴爾博士(Dr.Dale Umetsu)所領導的研究團隊，成功找出了連結肥胖與氣喘這兩個問題的關鍵性細胞，正是第三型的先天性淋巴球細胞(Type 3 innate lymphoid cells；ILC3)。這類型的先天性球細胞，有別於一般我們所熟知的後天性免疫系統中T及B淋巴球細胞，並不會表現任何專一性的淋巴細胞表面受體(TCR or BCR)，但在接受到刺激活化後，會快速釋放大量的IL-17細胞激素，因此這類細胞通常也被稱為ILC17。

戴爾博士的研究團隊發現:長期接受高脂飲食(high-fat diet)的肥胖老鼠，相較於正常飲食的控制組老鼠，會產生氣喘的典型病徵呼吸道過度反應，且在這些肥胖老鼠的肺部組織中，會發現分泌IL-17的ILC3細胞數量增加，IL-17是一種可促進發炎反應的細胞激素，在戴爾博士的研究報告中，無法產生IL-17的IL-17剔除小鼠，即使接受高脂飲食而變得肥胖，也不會產生呼吸道過度反應。進一步利用NLRP3剔除老鼠來探討其中的分子機轉，則發現高脂飲食中的脂肪酸會活化M1巨噬細胞(macrophage)的NLRP3發炎體(inflammasome)，產生大量的IL-1b，而IL-1b則會進一步刺激ILC3的增殖與分化，當直接由鼻腔給予Rag1基因剔除老鼠(這種老鼠體內缺少T、B細胞)IL-1b的刺激時，發現這些老鼠肺部會產生大量的ILC3細胞，並且出現呼吸道過度反應，顯示IL-1b在此致病機轉中的重要性。

這個新發現成功地找到了肥胖與氣喘間的連結。有別於一般由過敏原所誘發的氣喘反應，肥胖所導致的氣喘並非由典型的T細胞及其分泌的細胞激素來調控，而是由先天性淋巴球細胞ILC3扮演關鍵性角色。這個發現也呼應了臨床上對於肥胖型的氣喘病人，傳統的氣喘藥物類固醇(corticosteroids)經常無法有效控制氣喘反應，因為這類藥物主要功效皆為抑制T細胞的免疫反應，而非先天性淋巴球細胞。而在戴爾博士的研究中也發現:若改用另一種治療類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis )的藥物 Kineret ( Anakinra，為IL-1b受體的拮抗劑 (antagonist)，可阻斷IL-1b下游的訊息傳導路徑)，則可有效抑制高脂飲食的肥胖小鼠產生呼吸道過度反應。這個動物實驗的結果為今後肥胖型氣喘病人的治療提供了新方向。

下圖引用自 Nature Medicine 20, 54–61 (2014) Figure 6，用來說明肥胖誘發氣喘的分子機轉。高脂飲食中產生的脂肪酸(fatty acid)或膽固醇結晶(cholesterol crystal)，會刺激活化肺部或脂肪組織中M1巨噬細胞的發炎體(inflammasome)產生IL-1b，進而促進ILC3增殖與分化，分泌大量IL-17而導致氣喘的發生。利用IL-1b受體的拮抗劑(IL-1Ra)來阻斷IL-1b下游的訊息傳遞路徑，則可有效降低ILC3的數目以及IL-17的產生，抑制呼吸道過度反應。

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共同研究室貴重儀器訓練暨研究新知課程　

儀器訓練課程:課程網路報名

	3月12日	多功能溫控高轉速離心機(eppendorf 5810R)簡介與應用
	3月17~20日	電動倒立螢光顯微鏡實機操作(上午10:00 到 12:00 每日一場)
	3月19日	顯微鏡與影像擷取系統之操作教育訓練(Nikon,TS-100 &80i)
	3月19日	多功能 ELISA分析儀應用與操作說明(螢光、冷光、可見光)
	3月24日	活體及離體自由基測定儀的儀器原理及應用
	3月27日	冷凍切片機之簡介與實機示範課程(Leica CM 1900)

歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器訓練與研究新知課程講習相關資訊。

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為持續提供優質之研究服務，便於日後聘用專職技術人員、購置新儀器、現有儀器汰舊換新與維護保養等等，敬請於使用共同研究室資源並發表論文時，於論文致謝（Acknowledgement）處加入致謝共同研究室之文句，並於論文發表時通知共同研究室管理人員。致謝文句請依實際使用情形書寫，或請參考以下範例：We thank the staff of the Core Labs, Department of Medical Research, National Taiwan University Hospital for technical support.
　