醫學研究部(Department
of Medical Research)共 同 研 究 室 電 子 報
第三十六期 DEC.10.2016
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細胞免疫斑點影像分析儀(ImmunoSpot Analyzer)
尚博生物科技 張哲瑋先生
免疫斑點(ImmunoSpot)又稱為ELISpot(Enzyme-Linked ImmunoSpot)，是高敏感度(Sensitivity)的外泌性蛋白偵測技術，細胞所分泌的細胞激素(Cytokine)、抗體(Antibody)或特定的外泌性物質、…等，皆可在此平台上做偵測。
ELISpot的第一次文獻發表可追朔到1983年的瑞典，由Dr. Cecil Czerkinsky團隊發表於Journal of Immunological Method上的文章，其目的在於偵測B細胞所分泌的微量抗體。Dr.Cecil Czerkinsky團隊改良了ELISA的實驗流程(如圖一)：先將Capture antibody附著在培養盤底部，接著把細胞連同刺激物(例如：Antigen抗原、APC抗原呈現細胞、藥物、peptide...等)放入孔盤中一起培養。若細胞受到刺激誘導產生外泌性蛋白，就能立即地被培養盤底部的Capture antibody所抓取，避免蛋白稀釋在培養液中，隨後進行類似ELISA的呈色反應，接著就產生所謂的免疫斑點。
雖然當時ELISpot的技術理論已然成熟，但抗體的品質未達標準，更重要的是抗體(Capture antibody)與底盤的結合力差，故常常出現模稜兩可的實驗結果，導致於實驗結果重複性差無法標準化，故一直侷限著ELISpot的應用。
在1996年Dr. Paul Lehman使用PVDF (聚偏氟乙烯)膜作為ELISpot的底盤，改善原本塑膠培養盤對抗體的結合力差的問題，大大提升實驗的穩定性與一致性，讓ELISpot能與科學畫上等號；隨後Dr. Paul Lehman開發出世上第一台的ELISpot自動分析儀，才大大打開ELISpot的應用。
在ELISpot的實驗流程中，抗原特異性T細胞(antigen-specific T cell)會與抗原呈現細胞(APCs)或欲測試的抗原(antigen)一起培養，模擬真實的免疫反應。待免疫斑點呈色後，再由斑點影像分析儀自動掃描96孔盤，接著分析斑點數目與斑點型態；藉由分析每孔盤產生多少個斑點(Spots)和斑點大小作為免疫反應的指標，來推論活化T細胞顆數與其分泌的細胞激素。
ELISpot與常用的外泌性蛋白偵測平台做比較，其敏感度是ELISA(酵素連結免疫吸附法)與流式細胞儀平台的CBA (Cytometry Beads Array)和ICS(Intracellular Cytokine)的1000倍，能解析單細胞的蛋白分泌。舉ELISA來說，ELISA是待細胞完成分泌反應之後，取其培養液進行免疫聯酶反應，若細胞所分泌的蛋白濃度太低，往往無法呈色被偵測。除此之外，ELISpot能提供蛋白分泌的頻率(Frequency)資訊；在其他平台上，無法區分是"少量的細胞分泌大量的蛋白"抑或是"大量的細胞分泌少量的蛋白"，這對於研究者來說是很重要的資訊。
舉例來說，人類PBMC在沒有任何抗原刺激下，細胞本身就會分泌少量的細胞激素，經過特定的抗原刺激後才會產生大量且因刺激物產生的細胞激素。例如：偵測HIV患者PBMC的IFN-γ時，正常人和患者在IFN-γ形成的斑點數上並無明顯差異，但病患的斑點大小卻只有正常人的1/10，所以HIV並不是影響病人體內活化T細胞的數目，而是抑制了活化T細胞分泌INF-γ的能力，這樣的差異從ELISpot的斑點型態上，可以很直觀的看到差別。
近年來免疫學的研究如火如荼的進展，研究者發現到免疫系統並非由單一因子調控，而是藉由多種複雜的訊息傳遞途徑與各種因子共同參與，因此越來越多的研究者想要同時監測各種不同的蛋白分泌，其需求日益漸增。
現在的ELISpot可以同時檢測兩種不同的外泌性蛋白(Dual Color ELISpot)，藉由兩種顏色不同的斑點來標記兩種蛋白的分泌狀況(如圖二)；同時因應這樣多色的需求，ELISpot也發展出螢光的斑點呈色，我們稱之為"FluoroSpot(螢光免疫斑點)"。圖三為4色FluoroSpot的結果，同時檢測B細胞所分泌的四種抗體，包含：IgM, IgG, IgA, and IgE，其原理如圖四。
ELISpot的發展已經超過30年，技術不斷的演進改善，現今ELISpot已經是一個成熟穩定的技術平台，應用的範疇相當廣泛，像是疫苗開發、T細胞研究、過敏研究、移植研究，還包含近期很熱門的免疫細胞治療、癌症抗原篩選與疾病診斷。第七共研今年11月底新購入的細胞免疫斑點影像分析儀(ELISPOT)，機型為C.T.L. ImmunoSpot S6 Universal Analyzer，可同時進行多色分析，歡迎大家多多使用。
參考資料
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Handbook of ELISPOT：Methods and Protocols, Alexander E. Kalyuzhny, 2005
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http://www.immunospot.com/
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http://www.oxforddiagnosticlabs.com/
儀器訓練課程:課程網路報名
| 12月13日 |
細胞免疫斑點影像分析儀(ELISpot) 軟體應用與實機操作
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研究新知課程:課程網路報名
| 12月22日 | LSPR蛋白質交互作用分析儀新知課程 | |
| 12月29日 | 他山之石系列演講-傑出研究人員經驗分享與座談 |
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