醫學研究部 于家城博士  

一、自由基背景介紹：

原子是由原子核及外圍電子所組成，外圍電子以正旋及逆旋繞行於每一軌域中，因正旋和逆旋互相抵消磁性，每個軌域必須有二個電子才能產生穩定沒有磁場的原子或分子。若原子外圍有不配對的電子，必產生所謂順磁性（paramagnetism）或反磁性（diamagnetism），而這些不配對電子（和所在的基團合稱為自由基）會產生高度的活性，例如氫原子就是一個自由基。

碳（C）、氫（H）、氧（O）、氮（N）是有機物主要元素，其中氧還差二個電子就可形成八隅體（Octet）結構，所以氧有極大活性去接收電子而成為一有反應性的氧自由基。體內自由基95%以上是氧自由基，所以才有活性氧（reactive oxygen species）的稱謂。比較常見的氧自由基包括：sueproxide（O₂^●－）、hydroxyl radical (OH^●)、 singlet oxygen (¹O₂)、hydrogen peroxide (H₂O₂)。

在血管組織中，一氧化氮（NO）伴演一個重要生理調節角色，NO + O₂→ONOO^－，過氧化亞硝酸鹽（peroxynitrite, ONOO^－）是氧自由基的變種，我們稱之為reactive nitrogen species（RNS），反應性比氧自由基弱。

另外，自由基在細胞內何處產生？大家首先會想到粒線體，粒線體是靠傳送電子而產生能量，在能量產生的過程可能會因為缺O₂或粒線體內膜上complex I or III結構上的缺失而產生氧自由基。但是正常細胞內粒線體所產生的自由基僅佔總自由基的少量，細胞內還有許多酵素反應可產生自由基，例如：lipoxygenase, xanthine oxidase, NADPH oxidase等，也許這些反應才是自由基來源的大宗，而每種反應又要適當選取測自由基的方法才能測到所要的變化。

二、自由基的測法：

1.電子自旋共振法（electron spin resonance; ESR）

其原理有些類似核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）。前面曾說過成對電子的順、反磁性互相抵消，所以不會有磁場，但是自由基分子有顆單電子就會有磁場產生，而這種磁場所產生的電磁波可轉變成頻譜（spectra）被分析出來，這是目前偵測自由基最有公信力的方法。但體內產生自由基的量少，時間又很短暫，無法直接用這種方法偵測，需借助其它化學物質(例如5,5-Dimethylpyrroline-N-oxide等)，先接收自由基單電子形成穩定物質後再進行偵測。這些接收單電子的化學物質可應用於動物實驗和檢測人體分泌物或體液，但由於這些物質對人體副作用不明，目前還無法運用在臨床方面，但對於未來自由基的研究，由於其精確度高，較無爭議性，潛力是無限的。

2.螢光分子測自由基： 因為可測螢光的儀器普遍存在於實驗室，用螢光物質測自由基比較受歡迎，首先介紹兩種測陰離子氧自由基的方法。

(1)雙氯螢光黃乙酸乙酯（2',7'Dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFDA）

DCFDA是最為人所熟知的螢光物質，和一般發光物質類似，具有四個苯環。可通透細胞膜之後，被細胞內脂解酶 (esterase)作用而除去乙羧基而停留在細胞質中，DCFDA可與細胞內許多自由基物質反應（例如，RO₂^●, RO^●, NO₂^●, RS^●, CO₃^●－, OH^●和ONOO^－），但在測超氧陰離子（O₂^●－）時，效率慢很多，所以DCFDA測到的訊號是細胞整體自由基的變化。但此物質測自由基的能力也會受到鐵、銅、血基質蛋白（haemoprotein）、細胞色素C（cytochrome C）等影響，以及細胞內螢光蛋白因強光而釋放的自由基，使DCFDA所呈現的結果易遭到誤判。但儘管如此，使用DCFDA測自由基而在優秀期刊（Nature, Blood, and Cell）發表論文的學者亦不乏其人。

(2)二氫乙啶（dihydroethidium, DHE）

DHE通常用來檢測O₂^●－離子，二者作用之後產生2-hydroxyethidum（2-OH-E），2-OH-E會進細胞核與NDA嵌合而散發紅色螢光。但DHE與O₂^●－作用慢，反而與OH^●, NO₂^●, CO₃^●－或甚至血基質蛋白作用較快而形成各種其它的化合物，所以建議以HPLC測量2-OH-E的量，才是細胞內存在的O₂^●－的含量。而並非只是以紅色螢光的亮度來判斷。DHE如果再加進三苯基磷酸（triphenylphosphoninm）基團就容易嵌合在粒線體上而成為另外一種常用的偵測粒線體自由基的螢光染劑，稱之為MitoSOX red。

除了陰離子氧自由基需要測定之外，細胞內還有一項常見且較穩定的準自由基；過氧化氫（hydrogen peroxide），比較有名的螢光染劑如下：

(1)Hyper蛋白

Hyper蛋白是E.coli的OxyR蛋白和yellow fluorescent protein（YFP）複合體，OxyR是E. coli用來偵測環境H₂O₂的蛋白質，而YFP則是綠色螢光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的變種，當OxyR接收H₂O₂訊號後會誘發YFP螢光由綠變黃。Hyper是製造上述二蛋白質合在一起的一段基因，必須進入細胞表現成蛋白質後才可監測細胞內H₂O₂變化，Hyper蛋白不會對superoxide, oxidized glutathione, NO, ONOO^－產生反應，且不會有自發性的自由基產生，但會受到pH值改變而影響螢光，目前已有Hyper-2, Hyper-3和Hyper Red改良型式。

(2)硼酸去保護探針（boronate-deprotection probes）

通常是一含多苯環的螢光物質帶有一個單硼酸塩（mono borate），硼酸對於此螢光物質有遮蔽螢光效果，而H₂O₂的氧化能量可以使單硼酸塩脫離多苯環，而使多苯環物質的螢光得以展示出來。Peroxyfluor-3 或-6 (PF3 或6), Peroxy Orange 1（PO1）和Peroxy Yellow 1（MitoPY1）, MitoBoronic acid (MitoB)都是這個家族的代表。其中MitoB可貼附粒線體上，而偵測粒線體產生H₂O₂情形。ONOO^－也會和這個家族的成員作用，而且速度比H₂O₂快，所以有必要時可使用NO抑制劑（NOS inhibitor）去抑制ONOO^－的產生，以確保結果的精準性。Coumarin-7-boronate亦是單硼酸塩家族另一成員，與ONOO^－親和力高。Boronate被ONOO^－置換之後可形成7-hydroxycoumarin，呈綠色螢光。

以上所介紹的螢光染劑可分別偵測O₂^●－, H₂O₂ , ONOO^－。實驗室偵測螢光的儀器有多種，例如顯微鏡、流式細胞儀、ELISA reader等，利於進行各式分析。但螢光染劑價格較貴、又容易隨時間被漂白(quench)失效、易受pH值影響、有些螢光染劑因釋放單電子使得本身成為自由基，這些為其缺點。

3.以化學冷光劑 (Chemiluminescent probe) 測自由基：

自由基分子將自由基的能量轉給冷光劑分子，造成冷光劑分子從高能量分子釋放出光子而變成低能量分子，釋放冷光。冷光劑能量釋放可持續一陣子，所以可以被光電倍增管（photomultiplier tubes, PMT）所偵測，但因為細胞或組織所產生的冷光非常微弱，冷光劑通常需要非常敏感。也需要敏感度高的儀器才能偵測到，否則細胞內些微的自由基變化可能被淹沒在儀器的雜訊中。

目前共研有二台高敏感度自由基測定儀 (CLD-110, CLA-FSL，請參閱第三期電子報)。此型測定儀使用能偵測到10^-15∼10^-17 W/cm₂/sec能量子（相當於200個光子的光量）的光電倍增管，因其靈敏度極佳，非常適合用冷光劑來量化自由基。

最常被使用來量化自由基的冷光劑是魯米諾（luminol）和光澤精（lucigenin）二種冷光劑，請參考Fig.1和Fig.2所顯示發冷光化學反應流程。luminol是一用途很廣的自由基冷光偵測劑，很多自由基都可以和luminol反應，包括氧自由基，氯自由基和過氧化氫都可與luminol反應，luminol可以把微弱的自由基能量放大1000倍，如Fig 1所顯示luminol必須先獲得一自由基電子成活化狀態，然後可接受超氧自由基（O₂^●－）的氧化而釋放大量的光子。luminol是一很靈敏的冷光劑，所以建議檢體（例如細胞）最好放置在生理塩水中送進儀器檢測，以避免培養基可提供電子物質的干擾。另使用時應當天配製。總之，luminol是測量檢體中整體自由基含量，無專一性。但對於多形核白血球（polymorphonuclear leukocytes, PMNL）利用骨髓過氧化酶（myeloperoxidase）產生次氯酸（HClO）自由基這個步驟，luminol是一有效且專一的指示劑。

Fig 2顯示lucigenin產生冷光的流程。首先，lucigenin溶在水裡會呈正二價離子，不同於Fig.1的步驟2，Fig.2的步驟1需得到一個電子。在Fig.2的步驟2需要一個超氧自由基，此步驟有較高的專一性，所以lucigenin被歸類為測量超氧自由基的冷光劑。lucigenin對粒線體的親和力遠高於細胞質，大約相差百萬倍，因此進入細胞的lucigenin易聚集在粒線體中，而成為測量粒線體超氧自由基優良冷光劑。上述二種冷光劑目前共研皆可提供免費試用，對自由基測定有任何問題，歡迎與八共于家城博士討論。

三、參考書目及文獻

1. Halliwell B and Gutteridge JMC. Free radicals in biology and medicine. Chapter 6: measurement of reactive species, Oxford: Oxford University Press, 2015. (台大醫圖可提供借閱)

2. Woolley JF, Stanicka J, and Cotter TG. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends Biochem Sci 38(11): 556-65, 2013.

3. Vladimirov YA, Proskurnina EV. Free radicals and cell chemiluminescence. Biochemistry (Mosc) 74(13):1545-66, 2009.

                 Fig. 1 (From Biochemistry (Mosc) 74(13):1545-66, 2009) 

               Fig. 2 (From Biochemistry (Mosc) 74(13):1545-66, 2009)

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