醫學研究部 袁惠萍 小姐  

An Inconvenient Truth

還記得2014年日本研究者小保方晴子的STAP研究嗎? 在去年的Nature有一篇文章討論STAP事件，提及STAP 細胞的實驗數據無法被其他研究團隊重複的可能。其他團隊發現這株STAP細胞與保存於自己實驗室的胚胎幹細胞基因鑑定結果是一樣的。可能是最初小保方晴子的樣品中已經混入幹細胞，而非研究者所說由體細胞轉變而成(1)。事實上這並非唯一案例，只是STAP的研究較引人注意。科學界近幾年一直提出生物醫學研究結果重複性不佳的情況，這也成為持續待解決的難題(2)。

2014年底，美國國家衛生研究院(NIH)舉辦了工作坊，討論再現性(Reproducibility)的問題，並要求Preclinical Research投稿的數據結果須符合一套原則與指引(3)，這樣的共識被30多位著名期刊的編輯背書(4)。在去年，Nature 等期刊沿用同樣的想法(Good Reporting Standards)要求作者投稿時，必須完成檢核表(5)，其中作者必須提供完整的細胞株、動物、抗體、使用的溶劑資料與期刊內圖表所採用的統計方法。探究其中的仔細程度，以圖片來說，必須提供該圖實驗組別的樣本數、當中的生物重複和技術重複數(technical or biological replicates)、統計方法選擇、Error bar的定義等，以確保實驗結果的真實性。類似的策略也在其他期刊實施，例如共同研究室電子報第25期介紹的MIQE Guideline，就是期刊Clinical Chemistry要求投稿者須符合某些實驗方法指引，必需附上MIQE checklist。延伸閱讀Reporting Life Sciences Research(5)

科學家都了解NIH的新政策立意良好，但還是引起部分學界人士的反彈。FASEB協會(the Federation of American Societies for Experimental Biology)會長代表超過12萬會員寫了一封信給NIH，表示這樣的政策太倉促，需要時間準備。並且這樣單一的指引無法適合於所有的生醫研究，同時也增加研究人員的工作負擔。在缺乏品管的文化下，不意外學界會有如此反對的聲浪，要推行新的政策，必須要經歷一段時間的磨合和討論。目前NIH的指引大多著墨於數據報告(reporting)，其實就是品管活動中的「紀錄」，而其他的特殊要求，例如:是否有鑑定使用的細胞株(cell authentication )、抗體確效(antibody validation)和動物分組(blind and random)的方式，則陸續在科學界宣導。

順應這個趨勢，對於目前在生醫領域的我們，可以做些什麼?也許可以先看看指引的內容，對照目前實驗記錄本上缺少的資料，同時定期審視(check)資料的完整性和正確性，且由另一個人(非紀錄者)來審視紀錄本是否能了解內容。畢竟實驗室人員是流動的，實驗記錄將做為未來研究的傳承，所以紀錄本上的內容必須可以充分被理解。此外，善用手機攝影功能，拍攝影片也可做為是紀錄的方式喔!

製造業需要藉由品管品保來確保產品的品質和製造過程，若無法控制製程，會導致瑕疵品或良率低。而以實驗室而言，需要執行品管大多屬於檢驗實驗室，例如醫學檢驗實驗室(ISO 15189)。因為後續的檢驗報告會影響醫囑，所以檢驗報告的準確性可能影響到病人後續的健康狀況。執行品管活動也是主要控管風險的方式，控制可能發生錯誤的因素，並可預測發生失誤的機率。

　

表一在基礎研究與臨床檢驗兩者間的性質和差異。

在臨床檢驗中，要求測試方法的準確度和精確度，並藉由使用參考物質(Certified Reference material)讓量測值可追溯至國際標準的量測單位，也參與實驗室間的能力測試(proficiency test)，而基礎研究(本文討論對象為研究型實驗室)大部分是設計一個實驗來驗證假設，通常只有對照組和實驗組比較，若統計上有顯著差異，便可支持提出來的假設。因此，大部分的研究人員注重於後續統計檢定的p值，但有時會忽略流程中也需要控制(control)的細節，例如環境、人為因素、材料、儀器等產生的系統性偏差(systemic error)，而造成下一次實驗無法重複或是論文結果無法被其他實驗室重複的風險，所浪費的不僅僅是金錢、時間，還造成精神層面上的挫折。雖然研究型實驗室無須比照檢驗型實驗室通過認證，要達到如同檢驗實驗室的規模，似乎太理想化也不符合實際，但是仍鼓勵研究型實驗室採自願(voluntary)的方式，主動檢視實驗流程需要控制的因子，進而控管實驗品質。

Nature在今年一月份的文章--How quality control could save your science?您是否可在圖一，找出任何影響實驗的可能因素?

圖一找找看，那些操作/設備有問題? 答案請見延伸閱讀(6)。

以實驗流程來看，人、環境、材料、設備、方法、紀錄、統計方法是主要影響實驗品質的因素，以下舉例需要控制的因素:

1. 人員的訓練: 衛生安全概念、Pipetting 技術、儀器操作能力及熟練度。

2. 環境: 溫度(溫度計有定期校驗嗎?)、濕度、光照、其他環境干擾因子如:風速、正負壓差、振動、電壓電流穩定性等。

3. 材料: 細胞株(是否有定期執行cell authentication)、實驗動物(分組的方式)、抗體(是否有執行antibody validation)、試劑(效期是否標示/確認reuse緩衝液穩定性)、水質等。

4. 設備:各項儀器(是否有校正或保養)、滅菌鍋(要如何確認滅菌確效)、溫度計(是否定期校正或比對) 或3Q驗證等。

5. 測試方法: ELISA、flow cytometric method(是使用kit或是自行配製)、不同方法的敏感度及專一性比較、測試方法驗證與依據何項國際標準等。

6. 紀錄:其他人看得懂嗎?非預期的結果是否也有紀錄，以避免未來又重複做同樣的試驗?是否依照Good Documentation Practice記錄? 紀錄留存幾年備查? 論文查核時，重要原始數據可以追溯嗎?

7. 統計方法:樣本數量夠多嗎?統計方法適合該項實驗嗎?

必須在實驗計畫時，事先確認這些因子，並思考如何控制，後續才能維持實驗數據的品質。

實驗流程中的設備主要涵蓋硬體設施和儀器，而儀器是實驗室中最重要的工具，我們期望實驗室的儀器是穩定且準確的，但隨著時間儀器的零件狀況不如以前，儀器量測的系統性偏差(systemic error)可能加大整體偏差(total error)，而影響數據的品質。那究竟我們可以如何來控管這個要素?以下本電子報將主要介紹儀器的管理。

儀器管理的眉眉角角

大多的藥廠分析實驗室會參考美國藥典USP中Analytical Instrument Qualification(1058)章節討論分析儀器確效(7)。在此先瞭解細節，再以研究型實驗室的角度，考慮當我們進行儀器採購時，可能要注意的部分。為幫助了解概念，表二用生活中採購電視機的例子作為範例。

圖二建立品質數據的四大要素(UPS 1058 Analytical Instrument Qualification)。

要產生值得信賴並且一致的實驗數據，金字塔這四個因素非常的重要(圖二)。最底層的Analytical instrument qualification (AIQ)是最基本的部分，由四個活動所組成，分別是Design Qualification, Installation Qualification, Operation Qualification, Performance Qualification。在與供應商交涉的經驗中，並不是大家都了解4Q (大部分都是3Q)，有時甚至會得到研究型實驗室無須認證這樣的回覆，但是忽略了這四項，可能導致儀器後續的問題，所以我們來了解所謂4Q的含意:

1.  Design Qualification (DQ):採購儀器前須確認的購買計畫，包括欲測試的範圍、各供應商的規格、與使用耗品和其壽命、校正、維護計畫、供應商評價，作為採購參考以及後續支出經費估算。
   說明:坊間儀器太多種，如果許可的話，可以邀請廠商做儀器展示(Demo)，可幫助比較出不同廠牌的差異和使用者經驗，同時可要求廠商出具代理證明或事前評估耗材成本。有時候需考量儀器必須送回國外原廠維修，需耗時數個月的問題，同時也可事先瞭解供應商的儀器維修人員是否有接受原廠公司的訓練等。

2. Installation Qualification (IQ):證明儀器在運送後如同當初被設計的狀況，並且被安裝於適當的環境，當儀器換位置的時候，也能適用。需要有:
   (1)儀器的敘述(製造商、型號、序號、軟體版本、位置等)。
   (2)使用手冊、軟體、附件都有隨儀器送到目的地而沒有損壞。
   (3)確認安裝環境達到製造商的環境要求。
   (4)組裝後執行預先測試。
   (5)有些儀器會以網路提供數據資料的存取，一旦接上網路需再確認功能。
   (6)安裝完成後執行安裝驗證。
   說明:有時候要依儀器用途做考量，例如培養箱和冰箱的電源插座要能夠有停電緊急供電，有些儀器擺放的環境需控制溫度和濕度(例如顯微鏡)，儀器電源是220V或是110V，插座上供電電壓正確嗎?電腦可以裝防毒軟體嗎?會不會不相容?很多的因素要在安裝之前就要考慮過，後續再確認安裝是否可以符合當初設定的DQ。

3. Operation Qualification (OQ):儀器在IQ測試之後，操作確認儀器各項設備性能。當儀器維修後或移動位置，也需要再確認OQ。
   (1)固定的參數:例如長、寬、高、重量、輸出電壓等，有時這些參數會在IQ的時候一併做確認。
   (2)測試資料存取和備份:可行的情況下例如儲存、備份、歸檔的位置等。
   (3)儀器功能測試:包含面板控制鈕或軟體控制鈕是否正確地控制儀器運作。
   (4)建立儀器操作、校正、保養的規範SOP*。
   說明:輸入指令於儀器軟體或操作控制面板可以達到對應的要求或功能。以多功能ELISA reader為例，該功能可以提供螢光、冷光、可見光測讀。OQ就要看軟體是否可以控制這幾種功能。而HPLC由多個部分組合而成，需要確認壓力極限、Autosample、Pump、UV detector的功能。最理想的狀況要建立設備操作功能之書面資料和測試週期，包含操作、校正、保養、疑難排解的程序(SOP)，當然也包含清潔或例行保養流程和紀錄表格。

4. Performance Qualification (PQ):針對使用者設定的參數，確認儀器整體性能和穩定，以符合使用者需求。
   (1)功能測試:一般是要以標準品(含品管樣本)來測試儀器的功能，但是研究型實驗室可能找不到適合標準品或成本高，事先與廠商討論是否可以提供或設計一套或一個實驗來確認儀器是否可以達到預期的功能。
   (2)結合測試方法，建立以該儀器執行某測試的標準流程SOP* 。
   說明:因為儀器的種類太多，確認的方式也不一樣，最好與廠商討論。以醫學檢驗實驗室來說，因為是常規的檢驗，通常就會以該機器來執行特定測試方法確效，也借助品管樣本來確認是否達到允收標準。但在研究型實驗室，通常偵測目的不一，測試試劑多元，但使用者還是可以定義一個實驗來做測試。如果無法達成前述的功能測試，廠商通常會有儀器製造廠的校正品(Calibrator)來驗證儀器，這也可以達到部分的目的。以顯微鏡來說，將玻片放上載物台，由眼中看到的影像放大倍率是否如同操作時指定的放大倍率(但事實上要有量測工具來確認)，或是確定燈源穩定度(例如連續測試4小時，光源是否能穩定)，這過程中廠商也和使用者確定整體儀器的操作流程並建立SOP。
   *有時候這個SOP會在OQ和PQ發生，大部分的儀器廠商會提供簡易的SOP的內容，但就實驗室環境或儀器使用規則，該內容須被修訂成較完整的SOP。儀器管理者的SOP大多著重在操作、校正、保養的規範，儀器使用者的SOP屬於測試方法和前者結合的SOP。

為幫助了解概念，表二用生活中採購電視機的例子作為範例，介紹4Q的時機和活動：

表二修改自美國藥典USP(1058) Analytical Instrument Qualification(箭頭表示兩邊皆可發生)。

總之，以上的解釋說明確效測試的活動。某些驗證參數需透過第三方單位出具結果，而衍生費用，通常使用者須評量研究嚴謹度，最好於出貨前與廠商討論如何證明或請對方提供安裝測試、出廠證明、儀器性能測試等。最後，再配合使用者端可準備實際待測的樣本上機，以證明該儀器可達到量測的目的，以完成驗收。後續儀器每年或固定週期須校正或保養，以確保效能。若實驗室沒有經費執行校正等維護活動，將難以保證數年後的儀器與安裝時的性能一致，遑論想要在同一台儀器上重複先前的實驗數據。

如遵循院方採購和驗收流程，大部分院內儀器採購皆可達到預期的儀器功能目的。但部分實驗室並非每年皆有購買儀器的需求，若因研究人員流動經驗不足，有時可能無法掌握驗收條件，在此附上儀器採購簡單檢核表，提供給一般生醫研究室自行採購儀器時參考。

儀器購置後的後續維持，主要有幾項建議:

1. 建立實驗室的儀器設備的定期校正和維護計畫，並且有文件證明(紀錄)執行完畢，測試數據須在允許範圍內。
   (a) 若校正與維護計畫由內部人員執行，須要有標準作業程序。若為外部人員執行，也要確認其資格與執行方式。
   說明:通常由供應商派工程師執行較為適當。若實驗室有校正品可自行校正，需有標準作業程序供遵循。紀錄很重要，沒有紀錄就表示沒有執行。
   (b) 執行校正和維護計畫時，須注意並紀錄儀器內部耗材壽命、效能，以預估未來儀器故障的可能性花費。
   說明:若是在採購前了解可能的耗材壽命與費用，未來定期執行校正或維護時，可推測故障發生的時間，以事先準備耗材因應。
   (c) 與儀器供應商討論troubleshooting自我排解程序，以應變突發狀況，節省時間。
   說明:事先與供應商討論可能發生疑難情況，可自行排解的方法，通常說明書或操作手冊須提供疑難排解部分，提供突發狀況下的處理或可能原因。
   說明:儀器若完成校正或維護可以在儀器旁邊貼標誌(label)，以記錄並提醒下次執行時間。

2. 多人使用的儀器設備需要有預約及使用登記，並且制訂方法以執行清潔或維護，避免交叉汙染。
   說明:有些儀器因為共用，要建立清潔方法才不至於影響下一位使用者，若有登記紀錄較能追溯使用情況。

3. 若因研究需要，已建立一套固定之實驗技術，須撰寫成正式的標準作業程序(SOP)。此文件須為第二個人以上可閱讀並能重複實驗出結果。
   說明: 通常大家做實驗會參照protocol，其實也是作業程序，但是完整的標準作業程序須包含下列項目，實驗名稱、測試原理、樣本處理流程、儀器開機、操作、校正及品管、關機、儀器使用注意事項、異常排除、儀器保養、參考資料等。

4. 一旦開始從事研究計畫，應先區分出該實驗是否已為例行技術且已有現成標準作業程序可輔助操作者，有助於後續的新技術建立與文件歸檔。
   說明:研究型實驗室的操作通常樣本數少但是變化多，一旦使用某項技術發表論文，須建立標準程序，以利於後續供自己或他人重複實驗得以依循。另一方面，標準程序內容應具備什麼也需要討論。因為研究人員流動，即使設立了Protocol或程序書，但內容不完備將導致接續者操作不確定性，也是無法傳承研究技術。

5. 試劑、標準品等材料須要建立程序來整理標示，例如:品名、純度、濃度、使用期限、使用人、特殊限制，相關資料須建檔以維持實驗的品質。
   說明:實驗室購買後試劑、標準品後須訂定處理流程，例如化學品/抗體/試劑分裝、效期訂定、儲放位置等。或是制訂符合法規的化學品運作流程(流程範例)。效期通常詢問供應商，若是自行配置而無法得知，務必設計小測試來確認效果。

在圖二的金字塔第三層分析方法確效(Analytical Method Validation)，有時候會使用試劑(kit)或購買原料自行配置溶液。通常我們會借助不同濃度的標準品製作Standard curve或Calibration curve，以建立儀器反應和特定物質濃度的關係曲線(例如ELISA reader O.D. vs 濃度)，後續再由該曲線，以內差法推估樣品的濃度。

在檢驗實驗室，除了確認該曲線的R平方值、量測範圍(range)、量測極限(LOD&LOQ)等參數之外，因為講求量測準確和精確度，還會藉由認證過的參考物質(certificated reference material)在量測過程中當品管確認(Quality Check)，也就是圖二的第一、二層。藉由建立控制圖(Control Chart)來追蹤該標準品測量值(如圖三;8)，以了解整個系統在後續的試驗，包含儀器、方法、材料等的穩定度。

圖三控制圖(Control Chart) 測試同一物質的量測結果之數值應為常態分佈(如左邊的%信賴區間和標準差的關係)，藉由用該物質來監控批次與批次間的穩定性，設定Control chart上下方控制極限(Upper Control/ Lower Control)，監控數值的變化或趨勢(藍點)，以判別整個實驗流程的穩定性(8)。

以研究型實驗室而言，量測方法大多也會建立標準曲線(Standard curve)，通常期望曲線的R值>0.995，對於其他參數較為忽略。大部分的研究，只看現象或比較趨勢來解釋研究的假設，所以量測的偏差值(bias)較不注重，反而重視精準度(precision)。但我們仍然須留意不同的測試方法敏感度和專一性都不一樣，也會影響到想要觀察的現象，也因此採用不同的測試方法可能無法觀察到與其他論文相同的結果。

仍然建議使用適當的正控制組樣本(Positive Control)作為internal control sample以確認測試的方法穩定性。實驗室會自行製備大量控制樣本(In house material)，並將它分裝冷凍於低溫冰箱，做實驗時再與欲量測的樣本同步一起處理，通常預期該樣本會有正反應，以確認整體實驗的有效性。但因為這個正控制樣本的特性不像參考物質(certificated reference material)這樣的穩定，因此用自製正控制樣本所建立的Control chart，用來追蹤長期量測的穩定性就不適合。若是有品質穩定的參考物質，則可追蹤整個實驗系統，但成本太高。因此，研究型實驗室仍仰賴定期儀器的校正保養和試劑的效期，才能追蹤、控制整體量測的一致性和數據再現性。延伸閱讀--Control chart在ELISA的品管應用請參考文獻(9)。

優良的實驗室除專業技術能力外也需要行政、研發管理及品質管理系統，因此儘可能要求符合實驗室國際標準要求例如: ISO 17025、ISO 15189、GLP等(10、11、12)，甚至申請實驗室認證。對於生醫研究實驗室尚未類似的標準，但也因應NIH的新措施，我們將持續與大家分享研究品管的概念，如果有任何問題或想索取文件電子檔(提供自行編輯)，歡迎來信第七共同研究室袁惠萍小姐討論或索取。

參考資料：

1.David Cyranoski. Failed replications put STAP stem-cell claims to rest. Nature News.Sep 23, 2015.
2.Journals unite for reproducibility. Nature News. Nov 5, 2014.
3.National Institutes of Health.Principles and Guidelines for Reporting Preclinical Research. June 2014.
   https://www.nih.gov/research-training/rigor-reproducibility/principles-guidelines-reporting-preclinical-research.
4.National Institutes of Health.Endorsements — Principles and Guidelines for Reporting Preclinical
   Research.https://www.nih.gov/sites/default/files/research-training/initiatives/reproducibility/rigor-reproducibility-endorsements.pdf
5.Reporting Life Sciences Research. Nature Publishing Group. April 2015.
   http://www.nature.com/authors/policies/checklist.pdf
6.Monya Baker.How quality control could save your science?. Nature News. Jan 27, 2016
7. United States Pharmacopeia <1058> Analytical Equipment Qualification, USP, 2008.
8.Carl Berardinelli. A Guide to Control Charts.
9.John R. Crowther.The ELISA Guidebook: Charting Methods for Internal Quality Controlfor Competition ELISA.Methods in Molecular Biology, Volume 516:Chapter 10&13.
10. International Standard ISO/IEC 17025: General requirements for the competence of testing and calibration laboratories, 2005.
11. International Standard ISO 15189: Medical Laboratories – Requirements for quality and competence, 2012.
12. Organization for Economic Co-operation and Development. The OECD Principles of Good Laboratory Practice. OECD Series on Principles of Good Laboratory Practice (GLP) and Compliance Monitoring. No.1, 1997.

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