伯森生物科技產品專員 鄭博文 先生  

　

科學家為了進行癌症機制、器官修復、新陳代謝等相關研究，往往需要培養各式細胞。然而普通的培養箱卻無法確實營造體內細胞的生理環境，這是因為生理上細胞會不斷消耗氧氣，其週遭氧氣分壓比大氣中低。當研究人員為模擬生理狀況，以低氧條件(hypoxia)培養細胞時，會控制培養箱中的氧氣供給，但這並不能確知細胞週圍，甚至細胞內部的實際氧氣含量。建構一套能定量並精準監測細胞微環境氧氣含量的系統，對於真正掌握各器官組織中的細胞氧氣含量及體外各種不同氧氣培養的實驗含氧環境監測，有很大的幫助。下圖一顯示組織中各區域氧含量推估值，可提供進行低氧實驗的同仁參考。另外，醫研部提供組織含氧儀(第三共研)、細胞耗氧儀(第八共研)及細胞高、低氧培養箱(第三、第八共研)和氧自由基測定儀(第三、第八共研)等與氧有關儀器，歡迎同仁前來使用。

圖一、大氣中氧分壓為21 kPa，然而活細胞與組織的氧分壓卻可能只有2-3 kPa。1 kPa相當於1%氧氣體含量。

一、介紹:

一般而言，氧氣的測量，尤其是溶氧的測量，其方法以兩種原理為主：電化學法與光學法。

電化學法的歷史悠久，通常測量元件組成包含半透膜（對氧選擇性通透）、電極與電解液，並由外部電位迴路提供一持續電壓。自樣本逸散進半透膜內電解液的溶氧，在電極上以電化學的方式轉化，產生對應氧氣濃度的電流強度。其測量過程會持續消耗樣本的氧氣，樣本也需持續攪拌均勻，否則可明顯觀察到讀值下降趨勢。

光學法則以螢光測量氧氣：在螢光物質與氧分子接觸的情況下，氧分子扮演了消光（quenching）的角色，會降低螢光發散光 (emission)的強度(intensity)及減短螢光生命週期(lifetime)，氧氣濃度愈高此作用愈明顯，其關係可使用Stern–Volmer方程式描述：

與電化學法相比，光學法不會消耗氧氣，不需電解液，不需要頻繁地重新校正，更適合進行長時間觀測，現已漸漸成為生命科學領域的主流。

光學測氧系統OPAL，包含了主機硬體與螢光微粒兩大部分(圖二)。主機硬體能結合使用者原有的倒立式螢光顯微鏡，並連接到電腦，以專屬軟體操控主機與紀錄氧氣含量。

圖二、OPAL系統包含了控制器、可裝於顯微鏡的光源／濾片／偵測器，與螢光微粒。

螢光微粒則可用於偵測氣相或液相環境的氧氣，其主成份為生物相容性的球狀微粒，大小尺度分為奈米等級與微米等級兩種，表面皆覆蓋了對氧氣敏感的螢光染料，測量結果並不會被其它物質（例如氮氣、二氧化碳、甲烷、氫離子或其它培養液常見成份）的濃度高低干擾。ibidi推出了胞外偵測(CPOx)及胞內偵測(NanO₂)兩種螢光微粒，使用者可根據需要選擇應用。

只需將OPAL連接電腦與螢光顯微鏡，再將混合螢光微粒的樣本置於顯微鏡上，OPAL便能以螢光生命週期^註一的變化來換算樣本氧氣濃度（圖三）。相較於其它光學測氧系統往往以螢光強度換算氧氣濃度的方法，螢光生命週期不因激發光強度的變化，或螢光微粒濃度的高低所影響，測量結果具有較高的穩定性。OPAL另擁有雙頻相位調變 (two-frequency phase modulation) 技術，此技術能消弭來自背景螢光或樣本自發性螢光的干擾。以長時間觀測細胞氧氣含量實驗為例，細胞的爬行或新生死亡等變化都不會影響OPAL系統的測量。
註一、OPAL系統實際測量的螢光生命週期約為1-1,000 μsec，分類上已屬磷光(phosphorence)的範圍，為避免讀者感到困惑，此篇介紹皆以更廣義的螢光一詞替代磷光。

圖三、(A) 螢光微粒受光源激發後，其發散光螢光生命週期會受氧氣影響而減少。(B) 前述反應同時引發了發散光相位的位移，其位移程度可用於計算氧氣濃度。

二、應用範例：

為了研究藥物成份Acetaminophen致毒性的機制與粒腺體的相應動態變化，德國研究團隊捨棄傳統end-point assay，以 OPAL即時監測粒腺體的呼吸作用。為了模擬生理環境，研究團隊將HepG2/C3A細胞培養於流體環境，並連續監測氧氣含量長達一個月之久 (圖四)。

圖四、(A) 實驗系統建構。(B) 超過一個月的長時間氧氣含量偵測，以100%代表大氣中氧含量 (零消耗)。細胞在培養四天後對氧氣的攝取達到了較穩定的狀態。(C) 以螢光標定流體培養30天的活細胞(綠)與死細胞核(紅)，以及螢光微粒CPOx (橘)，比例尺為100 μm。

研究團隊接著嘗試加入不同濃度的Acetaminophen，可觀測到粒腺體對氧氣的攝取會受到大小不一的抑制，這個抑制作用明顯分成立即反應(斜率大)與慢速反應(斜率小)兩種速率模式。除此之外，只需將培養環境中的Acetaminophen於給藥後數小時內清洗掉就可以在短時間內回復對氧的攝取 (圖五)。研究團隊根據這些研究成果，推論Acetaminophen對肝細胞的傷害除了透過NAPQI之外也有其它路徑，這是以往單進行end-point assay所無法發現的

圖五、(A) HepG2/C3A細胞消耗的氧氣量在不同Acetaminophen濃度下的比較。 (B) 若對細胞處理12.5 mM的Acetaminophen再將其洗去，可回復粒腺體對氧氣的攝取。

三、結語：

當研究者細心控制細胞培養環境的溫度、溼度與pH值的同時，往往忽略氧氣的調控也是同等重要。這或可歸因於目前市面上並無簡單易用、可直接偵測細胞內外微環境氧氣含量的裝置，OPAL光學測氧系統的出現，適時地補上這個需求，加上其高解析以及即時監測的特性，成為科學家進行相關研究的一大利器。

四、參考資料：

Prill S, et al. (2015) Real-time monitoring of oxygen uptake in hepatic bioreactor shows CYP450-independent mitochondrial toxicity of acetaminophen and amiodarone. Arch Toxicol, 10.1007/s00204-015-1537-2.

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