一、核酸定序服務

(一)原理：自動化核酸定序採用Sanger dideoxy chain termination方法，以DNA為模板，加入4種去氧核糖核苷酸(dNTP)、4種標定不同螢光的雙去氧核糖核苷酸(ddNTP)與DNA聚合酶來進行聚合酶連鎖反應(PCR)。ddNTP與dNTP的差異只在3’端少一個氧原子，在進行PCR反應時，ddNTP會隨機的被加入正在合成的DNA片段中，一旦ddNTP被加入，因3’端少一個氧原子，無法與下一個核苷酸的5’-磷酸結合，使DNA合成中止。最終的定序反應將獲得各種長短不一且標記著螢光的DNA片段，以核酸定序儀將這些DNA片段進行毛細管電泳分離，在毛細管的終端以雷射激發螢光，再以CCD偵測，即可得知每一小DNA片段最後一個核酸序列，經電腦套裝軟體判讀排序，就可得到DNA片段的序列。
      

(二)定序服務須知：
1.本部定序服務所使用的機器為ABI 3730XL，PCR機器為ABI 2700 & 9700，試劑為BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit。

2.檢體製備：萃取後的DNA或PCR product請溶於 ddH₂O中（不可溶於含EDTA的buffer中），請依下表取所需要的DNA量置於200 ul 微量離心管中，若體積不足5 ul者，請補水至5 ul。

|‾	double-strand plasmid（0.2~0.5ug）
|	PCR product（2~3 ng/100bp）－請先確認為單一片段，且已移除PCR primer
|	phage or cosmid（2 ug）
|ˍ	single-strand DNA（0.25 ug）
*	請注意檢體之品質與量，且確認無殘留protein或genomic DNA

3.primer：請配成濃度為3~5 uM，每一管樣本加入1 ul (請注意一管只加一種primer)。本實驗室另提供T7，T3，SP6，M13 F與M13R 五種primer。請注意template及primer的濃度，量勿給太多或太少，以免影響定序結果。

4.欲定序的檢體請按檢體單的編號置於試管操作架上，檢體單上的檢體代碼請勿超過6個字（限英文字母＋數字）。

5.特殊定序：若檢體為shRNA、GC-rich或甲基化檢體，技術員可以特殊配方或特殊的PCR條件，來增加定序成功率，送檢者若有需求，請先來電或來信與技術員討論。

6.收費：依據台大醫院醫學研究部共同研究室儀器使用收費辦法辦理。一支檢體（一段DNA配一端的primer）100元，包括定序反應與上機，另特殊定序一支檢體120元，若需列印定序結果，需另付每張5元的列印費。因本收費標準僅計算耗材成本，且為避免浪費公用資源，請各研究人員先確定所送之樣本符合規定，因樣本不符而導致無法有好的定序結果，仍依本收費標準收費。

7.定序所得之報告有兩種格式：文字檔（.seq）與圖形檔（.ab1）。完成定序時會以電子郵件寄送，圖形檔可以下列幾種免費軟體開啟

	1.免費下載BioEdit軟體 http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html
	2.免費下載Chromas軟體http://www.technelysium.com.au/chromas.html
	3.免費軟體SeqScanner，請攜128MB以上隨身碟親洽技術員

二、片段分析服務

(一)原理：利用毛細管電泳區分帶螢光的DNA片段長度。螢光可標記在primer的5’端、dNTP或ddNTP上，經PCR產生帶螢光的DNA片段，再以定序儀進行毛細管電泳，與同時泳動的標準品進行分析運算，即可得知片段長度。此技術之解析度可達1bp，遠高於傳統跑洋菜膠的方式。目前可標記的螢光有五色，除了橘色(LIZ®)為標準品外，其餘四色(藍色6-FAM™、綠色VIC®、黃色NED™與紅色PET®)皆可拿來做標記。另可依實驗需求，設計出不同的片段長度，再加上四種螢光的標定，在同一毛細管內一起進行電泳，例如親子鑑定於同一管內進行多重PCR(multiplex PCR)，一次可分析15個微衛星基因點位(microsatellite loci)與性別標記。

(二)應用：片段分析廣泛應用於動植物血統鑑定、微生物檢驗、人類親子鑑定，或可用來偵測單點突變(SNP)、 增殖片段長度多型性（AFLP）、限制脢片段長度多型性（RFLP），單股結構多型性（SSCP）與基因去異質化（LOH）。

(三)收費：片段分析只提供上機服務，以一盤96孔為單位，一盤800元，使用者需自備上機所需的耗材（96孔盤、標準品）。本部備有GeneMapper4.1供後續的資料分析，或可用免費軟體PeakScanner進行片段長度判讀。

三、核酸定序與片段分析服務的負責技術人員為劉怡里小姐，分機65781，電子信箱 aliliu@ntu.edu.tw，若有任何問題，歡迎來電或來信討論。

四、本部不定期舉辦教學訓練課程，歡迎訂閱共研電子報以收取相關訊息，即時報名上課。部份課程備有教學影片，若有需要請洽儀器負責人。

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