必帝(BD)儀器股份有限公司應用專員 林秀鴻小姐

繼第二十四期介紹之「細胞週期分析簡介I」，此期針對細胞週期分析進行更詳細的介紹如下：

一、Ploidy多倍體

生殖細胞的染色體數稱為倍體數, n, 在體細胞的倍體數是二倍體 diploid, 2n。某些體細胞會是四倍體tetraploid ,4n, 或甚至八倍體 octaploid, 8n。腫瘤細胞的倍體數有時大於2n (hyperdiploid), 有時小於2n (hypodiploid)。不正常的染色體數則稱為非整倍體數, 會反映在DNA量的改變上。

若量測到DNA量的改變,  會稱為aneuploidy 非整倍體, 在腫瘤細胞中可以表示為DNA index (DI), 其定義為腫瘤細胞及正常二倍體 DNA含量的比率。在臨床樣品中, 有時會加入小雞 (chicken) 或鱒魚 (trout) 的胸腺細胞 (erythrocytes)作為標記, 使樣品的倍體數更容易被判別。原理是禽類與魚類的胸腺細胞DNA比人類細胞少，如下圖所示。

圖一. 兩份乳癌細胞樣品的DNA 直方圖. C: chicken erythrocytes小雞胸腺細胞; T: trout erythrocytes鱒魚胸腺細胞; D: diploid cells 二倍體: A: aneuploid cells 非整倍體細胞. 波峰的寬度 (CV) 顯示在圖上.

二、DNA直方圖的品質

在Cell cycle的實驗中, DNA直方圖數據的品質是使用G1的波峰的寬度評估的，亦即使用標準差 (Standard deviation, SD)計算出來的變異係數 (coefficient of variation, CV)。CV = 100 x SD/(peak channel)%, peak channel是波峰的平均道數(跟儀器的解析度有關)。

CV值越小, 量測倍體數及不同周期細胞的百分比就越精確。任何會使CV增加的因素都應該被消除, 例如:儀器未校正、細胞團聚、細胞碎片的存在等。在非整倍體的腫瘤細胞有機會獲得低於1%的CV值, 由於DNA含量的異質性, 一般培養的細胞最佳則可接近至2%。

獲取高品質的直方圖數據關鍵在於1.樣品的製備 2.儀器的校正及3.數據的分析。

樣品製備的最重要目標是獲得單細胞(或核), 同時避免細胞碎片及團塊的產生。最佳的製備方式是獲取細胞核, 使用PI染色時必須加入RNase反應足夠時間以移除所有的雙股RNA。假如細胞已被固定, 可將細胞置於4°C隔夜, 亦可改善直方圖品質。如果細胞或細胞核的濃度很高, 需加入足夠量的染劑以維持染劑與DNA之間的化學動態平衡結合。

儀器的狀態可使用已知CV值的螢光微珠檢查, 如果檢查出的CV超出可接受範圍應該檢查以下事項以確保儀器的表現。

1. 檢查流速 (flow rate) 是否被設定得太高

2. 檢查樣品偵測區(flow cell)是否被部分阻塞

3. 告知維修工程師

任何樣品流的擾動都會增加CV值, 因此細胞或者細胞核應該維持高濃度(5x10⁵-2x10⁶/ml)

而流速維持低流速。DNA直方圖須以線性方式 (linear) 呈現數據。

三、分析時得到單細胞的數據

兩個G1期的細胞或細胞黏在一起時, 會有與一個G2期細胞相同的DNA含量。但這兩者在DNA直方圖上理應被區分出來。由於液流系統的關係, 細胞團塊的方向會與液流行進方向一致, 並且會產生相較於單細胞較寬的訊號波峰。G2/M細胞的DNA含量是G1的2倍，但核的直徑大約只比G1大25%。因此G2/M細胞會產生比較高的訊號波峰(Height)但較窄的訊號波峰寬度(Width)。某些儀器設計為可顯示寬(width)對面積 (Area),某些則是高度(height)對面積(Area)。如下圖

圖二.不同時期細胞核經過雷射時產生的螢光訊號示意圖。

圖三.利用顯示DNA-A與DNA-H去除細胞團塊

圖四.利用顯示DNA-A與DNA-W去除細胞團塊 (BD FACScan)

四、使用電腦軟體分析細胞週期

下圖為G1, S 及 G2/M 期的細胞疊加圖, 細胞時期同時使用BrdU分析, 由數據圖中可觀察到早期S phase的訊號與G1有一定量的重疊, 而晚期S phase的訊號與G2/M細胞訊號有重疊。這是由於訊號分布的寬度與細胞染色, 與儀器誤差造成的。解決這個問題的方法是尋找評估重疊程度的數學模式。

圖五.V79 Chinese Hamster 細胞以BudU 標誌後以anti-BrdUrd-FITC (S phase cells) 及 PI (cell cycle)染色偵測。左圖被標示為G1, S 及 G2/M 的族群及其 DNA 直方圖被疊加後顯示為右圖, 訊號重疊的部分為箭頭所標示區。

下圖顯示了電腦分析DNA直方圖的結果。兩套最常見的商用DNA分析軟體分別為ModFit  (Verity Software) 及Multicycle  (Phoenix Flow Systems)。

圖六. 血癌細胞株, L1210的細胞與Pt dicarboxylate培養不同時間後以70% 酒精固定; PI 染色

五、多參數偵測 (Multiparameter measurement)

(一)、結合散射光與DNA染色分析

有時散射光可揭露額外的資訊, 用以分別不同的細胞族群, 下圖七可使用gating的方式分別處於正常細胞周期與被停止於G2期因而大小增加的細胞群。

圖七.血癌細胞與Pt di-carboxylate作用48小時後, 利用散射光(FSC/SSC)分別正常大小細胞 (small)與停留在G2 phase的細胞 (large)

另外一個例子是使用福馬林固定, paraffin包埋的乳癌細胞(圖八), 未進行圈選的DNA直方圖顯示有二倍體族群及非整倍體腫瘤細胞, 而以此種方式製備的細胞核, 正常細胞的細胞核顆粒性較弱, 腫瘤細胞的細胞核顆粒性較強, 可藉由此分辨出腫瘤細胞同時具有二倍體及非整倍體。

圖八.乳癌細胞細胞核, 使用散射光分別兩個二倍體與一個非整倍體細胞群。

(二)、結合免疫螢光與DNA染色

結合PI與單一螢光抗體染色並不會有任何問題, 但若使用與PI有相近光譜的PE螢光抗體往往無法進行螢光補償, 因此最好使用與實驗中搭配的螢光發散光譜最少重疊的DNA染劑。若儀器有UV或violet雷射, 可使用DAPI以讓出藍光雷射與紅光雷射的偵測器給其他抗體的螢光使用。

如果使用細胞表面抗原與DRAQ5或Hoechst 33342等可以活染細胞的DNA染劑, 就無需固定細胞；反之, 如果使用的是PI或DAPI便需要進行細胞固定, 在同時使用表面抗體的狀況下會產生一些困難, 需要選擇合適於表面抗體與DNA染劑的固定條件, 通常會使用methanol作為相容於兩者的固定液。雖然對於兩者來說都不是最佳條件, 但已足夠產出合理品質的DNA直方圖數據了。

圖九.卵巢癌病人的腹水細胞已MOv18-FITC抗體染色, 以福馬林固定並以vimentin-PE染色。表皮的腫瘤細胞是非整倍體, 而正常表現vimentin的細胞是二倍體。

對細胞內的抗原來說, 則須根據目標抗原的不同有不同的處理方式, 幾個典型的處理方法如下:

• 細胞於0°C 以70%酒精處理, - 20°C以100% 甲醇固定

• 1% paraformaldehyde 福馬林固定後再以methanol甲醇固定, 0°C

• 新鮮細胞於含有detergent與抗體的buffer中染色

以下三個例子顯示了使用細胞週期相關的蛋白質作為目標同時進行染色, 圖十(A)顯示 cyclin A的分布。減數分裂的過程中cyclin會降解。 (B)使用會染上 p-histone H3的抗體, 偵測減數分裂的細胞。圖十一則是使用會在G2表現但減數分裂時不表現的cyclin B2。

圖十.K562 細胞以 (A) cyclin A 及 (B) p-histone H3 (FITC)染色。.細胞先以 1% formalin固定再以甲醇固定。

圖十一.Human lymphoblastic 細胞, W1L2, 以cyclin B-FITC染色。 細胞以70% 酒精固定, PI染色。

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