醫學研究部第七共同研究室 袁惠萍小姐

在2015年10月自然雜誌有一篇文章提及美國細胞生物學會於今年度做了一項調查，超過2/3的科學家曾經無法重複自己已經發表的實驗結果(1)。為解決研究成果是否能有再現性問題，此篇也提出Good institutional practice的想法，賦予研究機構監督的責任。同年七月份發表在Genetic Engineering & Biotechnology News一篇文章(2)，提及研究無法被重複的問題，也提出優良研究規範(Good research practice)要比照現行的臨床試驗導入查核概念，以增加數據真實性並進而減少研究經費的浪費。由以上的資訊顯示實驗品質的重要性，但因現行的研究機構並無規範和文化做類似檢驗部門之品管查核，直接導入品管是有必要但不容易的事。本期電子報將以Real-time PCR為例子，概略地介紹MIQE guideline 與其檢核表(checklist)，供本電子報的讀者了解MIQE guideline的目的和精神，讓目前操作Real-time PCR的研究人員有遵循的方向和規範。

MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments

Real-time PCR (即時核酸定量連鎖反應)是一個非常重要的分子診斷實驗，在生命科學、醫學、農業等皆廣泛被使用來進行核酸定量，例如:病原微生物定量、基改食品、鑑識醫學、癌症復發等檢測。雖然這個技術趨於成熟，不外乎主要四個階段如圖一。過程中使用的保存方法、萃取方式、RNA品質、反轉錄酶的廠牌、Primer設計的片段、分析方法等，種種變因是無法在發表的期刊上得知，也因為缺乏足夠的研究資訊，導致研究人員時常無法重複數據結果，往往造成時間與金錢的浪費(3)。

一群由PCR專家組成的國際會議，在2009年提出 MIQE guideline (4)，目的是希望提供一個核酸定量連鎖反應實驗之執行指引，若研究者採用該技術的研究結果來發表論文，在投稿時至少需要提供的資訊。MIQE guideline的檢核表中-必須項目(essential item)和建議項目(desirable item)，以證明數據的真實性和透明度。研究人員可知悉實驗細部設計和結果，立即重複實驗，促使實驗數據的可信度，也加速科學研究發展。

這個指引第一部分釐清過去使用的專有名詞，並將用語標準化(表一)。第二部分則概念性地解釋分析方法的敏感度(analytical sensitivity)、分析專一性(analytical specificity)、準確度(accuracy)、重複性(repeatability)和再現性(reproducibility)。第三部分則討論PCR在研究與臨床應用上的差異(表二)。

表一 專有名詞標準化

註:本文之後皆以qPCR取代Real time PCR。

接下來的指引內容皆在討論qPCR實驗四個主要流程，需要考慮的項目: RNA品質、反轉錄反應、定量PCR反應、數據分析(圖一)(3)。首先，確認實驗的目的:確認基因表現或是SNP? 其次是樣本是DNA或RNA? 樣本取得的方式和保存的方法? 有確認純度嗎? 使用什麼方式取得反轉錄DNA?等許多參數和條件，請配合Checklist (表三)來查核自己的實驗執行和紀錄是否符合要求。

圖一 影響決定qPCR實驗數據之重要流程和參數(5)

表二 qPCR在研究與臨床應用上的差異

表三MIQE Checklist說明
(重要性: E(Essential)代表必要符合，D (Desirable)代表在可行的情況下，建議符合)

註
1. Agilent 2100 Bioanalyzer可分析RIN, RNA integrity number ; RQI, RNA quality indicator，主要目的確認RNA integrity是否degrade (降解)。
2.抑制效應:可能在萃取核酸時，因為有機溶液或離子的存在會干擾後續PCR的反應，因此就由序列稀釋或是外加物質(spike method)來確認是否樣本是否存在抑制物質。
3.要求要提供核酸序列，但對廠商來說可能涉及商業機密，所以通常在此為建議。
4. 標準曲線:確認該系統(合成的Primer、酵素、其他添加物)是否可達到理想中的PCR效率，藉由建立標準曲線(序列稀釋vs. Cq)。由斜率推算PCR效率Efficiency = 10^(-1/slope)。
5. 線性關係範圍:通常Cq值>40，被判定為undeterminated。但是對於Cq值為介於36~40之間，數值可以相信嗎? 若是建立分析方法標準曲線，可確認該測定方式下，其量測範圍與信賴區間為何。

因為qPCR的實驗種類或方法有數種，不見得每個項目都必須符合，例如: 絕對定量則不用選擇reference gene，但是相對定量需要。因此需要就個別的研究性質做討論。在此提供一篇論文採用MIQE的範例連結(本文/ MIQE Checklist)以供參考(5)。MIQE guidelines涵蓋了大部分實驗的細節，雖然檢核表內沒有涉及儀器的校正保養部分，但已就實驗流程和設計部份有所把關。

目前美國臨床化學學會(American Association for Clinical Chemistry)採用MIQE guidelines，所屬之期刊Journal Clinical Chemistry表示若投稿的內容涉及qPCR實驗，則須提供MIQE checklist及相關資訊。此外，Oxford Journals系列期刊- Nucleic Acids Research 也鼓勵投稿者完成guideline要求，協助審查者和科學家檢視實驗品質。期許研究人員可自主性(voluntary)落實MIQE guideline於自己的研究，一方面，對同一個實驗室內部來說，建立透明化研究資訊可做為內部數據紀錄，以便未來供後人追溯和重複實驗。對其他實驗室之間引用文獻時，從該論文提供的MIQE 資訊中，則可快速地去驗證真實性，進而得以安心地進行下一階段的研究。另一方面，對於MIQE的重視也促使試劑業者開發有關協助品管之產品，以利於實驗品質。若未來以相同的態度來進行其他生醫實驗品管，相信可改善重複性與再現性的問題。

MIQE 也有專屬App喔!!!
　

自從2009年，MIQE被提出後，多家的qPCR儀器試劑廠商皆開始推廣MIQE的概念與精神，希望科學家將它落實在自己的研究，同時也協助研究者可以更便捷的將MIQE導入實驗裡。查查看您的平板或智慧型手機，是否可以找尋到MIQE app (圖二a)? 此套系統是由Bio-Rad公司建立的，可支援iOS和Android系統。藉由建立單一實驗，可打勾確認實驗或記錄符合Checklist的項目。當手邊沒有檢核表紙本的時候，app便可協助做紀錄。此外，這個app還有MIQE項目的文獻連結，像是MIQE的資料庫。除此以外，推薦Life technology公司(已被Thermo Fisher Scientific併購)的app: Real-time PCR(圖二b)，提供很多PCR應用資源供查詢，其中的Reaction Calculator可以協助計算上樣時，配置樣品和試劑的濃度和體積計算，研究人員可多加利用。

同樣的，Roche公司也設計了網頁，人性化的介面(Step by step)協助完成MIQE checklist。上個月蘋果線上商店iBOOK 上架了一本免費的電子書MIQE &qPCR:如何將MIQE guidelines應用到實驗，但目前台灣的Apple Store並沒有上架。為提倡更多研究人員了解MIQE guidelines，今年度七共將舉辦MIQE的新知課程。若您對MIQE有興趣或有任何問題，歡迎您的參加。若想獲取進一步上課消息，請填寫聯絡表單。

圖二a . MIQE app 的查核表範例畫面

圖二b. Real-time PCR app 範例畫面

參考文獻:

1. Robust research: Institutions must do their part for reproducibility. Nature 525, 25–27 (2015).

2. Biomedical Researchers Need Data Audits. Genetic Engineering & Biotechnology News. GEN Exclusive, July 16 (2015).

3. The need for transparency and good practices in the qPCR literature. Nature Methods 10, 1063–1067 (2013).

4. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chemistry 55:611-622 (2009).

5. Estrogen-induced upregulation and 3′-UTR shortening of CDC6. Nucleic. Acids Research. 40: 10679-10688 (2012).

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