醫學研究部(Department
of Medical Research)共 同 研 究 室 電 子 報
第二十四期 DEC.10.2015
本期目錄
下期主題
品管分析
快速連結
本期電子報主要針對流式細胞儀的應用—細胞週期（cell cycle）進行介紹。下期電子報將介紹Real-time PCR之品管相關訊息，MIQE guidelines，這是某些期刊對於發表即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)數據時，有著最低需求。這樣的要求對於進行Real-time PCR實驗，可以進一步掌握研究品質，提升數據準確性。敬請密切注意!並竭誠歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器介紹、研究新知、與每月訓練課程資訊。更歡迎您與我們聯絡，給予我們建議與鼓勵。
醫學研究部流式細胞儀核心實驗室新增第二台FACSArial
III分選儀，配置有488,561, 633,405 nm四支雷射，並已於11月10日起，開放下午時段預約使用，歡迎舊雨新知踴躍上網預約。共研其他儀器設施之網路預約系統陸續建置中，感謝您的耐心等待。另本月份「臺大醫學校區學術演講及研討會公告平台」尚公告多場精彩演講及課程，歡迎同仁查詢利用，並踴躍申請帳號發佈訊息。希望我們所提供的設備對您的研究有所助益，服務品質也令您滿意，為了共研長期的經營運作，請您於發表文章時惠予致謝共同研究室，作為服務成效評鑑之用。
TOP
必帝(BD)儀器股份有限公司應用專員 林秀鴻小姐
一、前言
流式細胞儀透過液流將細胞懸浮液送至雷射前端對細胞進行物理特性(相對大小/顆粒性)，生化特性(marker, ligand, receptor, cell function)的分析，從而識別細胞身分，獲得統計資料，或了解細胞於特定狀況下的生理反應或表現。除了最主要的應用免疫表型分析外，本期電子報所介紹的細胞週期分析(Cell Cycle Analysis)是流式細胞儀上主流應用之一。
二、介紹
DNA分析，是除了免疫螢光染色以外流式細胞儀的第二重要應用。透過量測個別細胞的DNA含量，我們可以獲取關於細胞倍體數的資訊，特別是在某些腫瘤中，及細胞群體中的細胞週期的分布。 DNA直方圖與細胞週期的關係如下圖所示。
三、進行細胞染色:
為了量測DNA，必須使用核酸染劑進行細胞染色反映細胞中的DNA表現量。目前有非常多種DNA染劑，這些染劑在水溶液中螢光非常微弱，一旦與DNA結合便會因為疏水性環境的關係表現強螢光。
常用的核酸染劑整理於下表:
| 螢光物質名稱 | 激發波長ex(nm) | 發散波長em (nm) |
| 355nm UV laser | ||
| DAPI | 372 | 476 |
| Hoechst33342 | 395 | 450 |
| Hoechst33258 | 352 | 455 |
| VD violet | 369 | 437 |
| 488 Blue laser | ||
| PI | 342, 535 | 617 |
| EB (Ethidium Bromine) | 320, 518 | 605 |
| AO (Acridine orange) | 503 | 530(DNA)/640(RNA) |
| 7-AAD | 546 | 647 |
| DRAQ5 | 646 | 697 |
| TO (Thiazole orange) | 512 | 533 |
| YO-PRO-1 | 491 | 509 |
| VD Green | 506 | 534 |
| VD Orange | 519 | 563 |
| 640, 633nm Red laser | ||
| TO-PRO-3 | 642 | 661 |
| DRAQ5 | 646 | 697 |
| 458 nm laser | ||
| Chromomycin A3 | 430 | 580 |
最廣泛被使用的核酸染劑為propidium iodide PI，可被488 nm雷射激發為紅色螢光，PI有兩個缺點：1. 它會與所有雙股的核酸結合，包括雙股RNA，因此需要加入RNase去除雙股RNA 2. PI無法直接穿透細胞膜，因此染色前需要固定並通透細胞。最簡單的方法是以70%的酒精固定細胞，另外一個選項是將細胞懸浮在含有detergent的buffer裡。(Vindelov, 1983; Petersen et al., 1985)。下圖為一典型的Cell Cycle DNA直方圖，來源為臨床的樣品，使用PI染色。
圖一 乳癌細胞的DNA直方圖，細胞以針筒吸取後離心並回溶於含有detergent,PI及RNase的buffer.非整倍數的細胞樣品中有正常，與雙倍的細胞同時出現。
如果有UV或者Violet雷射，可以使用DAPI,DAPI具有膜穿透性亦可產出高品質的直方圖。研究者亦可使用DRAQ5(Vybrant DyeCycle染劑之一)或Hoechst 33342(需UV laser)。
在進行正式實驗前，針對不同的細胞種類進行條件的測試以設定合適的染劑濃度與染色時間。
臨床的樣本處理通常由福馬林固定，paraffin包埋的組織萃取細胞核。50 µm厚的切片從組織塊切下，移除paraffin後以pepsin萃取核酸(Hedley et al., 1983)，數據的品質通常可藉由在以pepsin處理組織切片前先將切片加熱至80°C (Leers et al., 1999) 獲得一定程度的改善。
更多精彩的內容，敬請待續∼
四、醫研部共同研究室流式細胞儀配備
| 共研別 | 廠牌/型號 | Laser | Emission Filter（nm） | Autosampler | Software | 費用* | 聯絡人 |
| 三共 | BD LSR II |
488
nm |
488/10 530/30 575/26 695/40 780/60 |
No |
FACSDiva
FlowJo |
25元/15分鐘 |
楊凱婷 張芸寧 #65725 |
|
633
nm （3色） |
670/30 730/45 780/60 |
||||||
|
355 nm |
Side population analysis 670/14 450/50 |
||||||
|
Multicolor analysis 530/30 450/50 |
|||||||
|
Spare filters （依使用者需要由管理 人員進行抽換與設定） 405/20 585/42 610/20 |
|||||||
| BD FACSVerse |
488 nm |
488/15 527/32 586/42 700/54 783/56 |
Yes | FACSuite | 100元/時 |
歐陽璞 #65725 |
|
|
640 nm (2色) |
660/10 783/56 |
||||||
| 四共 | BC Epics XL-MCL |
488 nm |
525 575 620 675 |
Yes | EXPO32 ADC |
無 (buffer自備) |
張瑞宗 #66680 |
| 七共 | BD FACSCalibur |
488、635
nm (3+1色) |
530/30 585/42 670 LP 661/16 |
No | Cell Quest Pro | 100元/時 |
袁惠萍 #63162 |
| 八共 | BD FACScan |
488 nm |
530/30 585/42 >670 nm |
No | Cell Quest |
無 (buffer自備) |
洪煜堃 #63480 |
| BD FACSVerse |
488 nm (4色) |
488/15 527/32 586/42 700/54 783/56 |
Yes | FACSuite | 100元/時 | ||
|
640 nm (2色) |
660/10 783/56 |
||||||
| 九共 | BD FACSCalibur |
488 nm |
530/30 585/42 >650 nm |
No | Cell Quest |
無 (buffer自備) |
李昇憲 #67834 |
* 費用依目前FACSFlow廠商售價與各機台實際使用情形計算，每次付費為一桶之整數倍。
研究新知課程:課程網路報名
| 12月15日 | 生物標的(Biomarker)蛋白偵測的新趨勢 | |
| 12月23日 | 拋棄式微流體晶片細胞分選儀新知課程 | |
| 12月23日 | 細胞治療中心第三次工作坊-Manufacturing of Cellular Product,City of Hope experience |
歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器訓練與研究新知課程講習相關資訊 。