一、前言

黴漿菌是一種能夠自我複製的最小的原核微生物，屬厚壁菌門柔膜菌綱，但和其他細菌不同的是它們沒有細胞壁，所以細胞形態不固定，可以有多種變化，且也可以在培養基上形成極小的菌落。由於不具細胞壁，許多常見的抗生素，如盤尼西林或β－內醯胺類抗生素對黴漿菌是無效的。

黴漿菌是細胞培養常見且棘手的汙染，發生率高，不易以肉眼發覺，且難以清除。受到感染的細胞不會呈現死亡或其他視覺可辨別的跡象，但確確實實會影響細胞的生長狀況，進而影響實驗結果或生物製程的產出，因此在進行細胞培養時，定期監控黴漿菌汙染是必須執行的計畫。一般傳統的黴漿菌偵測法粗略分為三種: 細胞培養法、PCR檢測法以及冷光偵測法，其原理與操作方法說明如下:

二、黴漿菌偵測方法

(一)、黴漿菌細胞培養法:

(1)操作原理:

將黴漿菌培養於專用培養基中，觀察菌落之生成。目前此方法最為直接靈敏，亦是用來評估其他新偵測方法之標準步驟之一。缺點則為培養時間長，須3~5星期才能判斷，且有些黴漿菌不易在目前現有配方之培養基中培養出來(例如 M. hyorhinis)。

(2)、測試時間:

黴漿菌生長速度較慢，所以除了接種於mycoplasma agar plate外，亦同時接種於液體培養基增殖一週及二週後，取樣轉殖至agar plate培養至少3星期後，才可斷定是否有黴漿菌污染，所以整個測試需五個星期才能得到結果。

(3)、結果判讀:

典型之黴漿菌菌落外型似荷包蛋(fried egg-like)，為圓形無色之細小透明菌落，可藉100倍放大倍率之顯微鏡觀察。若要區分是否為由細胞樣品中其他污染源所形成外型相近的菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養於液體培養基中，培養一星期後再種入agar plate，觀察菌落之形成；或將其自agar plate上切下，重新以其他黴漿菌測試方法檢測〈例如DNA螢光染色或PCR方法〉。若有非荷包蛋型之菌落出現，則需與其他黴漿菌測試方法比對〈例如DNA螢光染色或PCR方法〉，再判定測試結果。

(二)、PCR檢測法:

(1)原理:

利用具專一性之primers，經由PCR反應來複製mycoplasma DNA。所用之primers來自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由於此段spacer序列依mycoplsma種類不同而不同，因此可依所複製之DNA大小及其restriction fragment大小差異來作偵測與鑑定。

(2)優點:

1. 靈敏度高(0.1~1.6 CFU/5 ul sample)且快速(一天)。

2. 可偵測不易培養之mycoplasma (例如 M. hyorhinis)。

3. 不需額外培養mycoplasma作為正反應對照組，避免可能之污染。

(3)缺點:

因反應靈敏易發生偽陽性，故此方法尚在評估中，其結果僅作為參考和內部品管使用。

(三)、黴漿菌快速冷光偵測法

黴漿菌快速偵測試劑是偵測黴漿菌的代謝酵素活性，這些酵素存在於六種主要造成細胞培養的黴漿菌，並且也廣泛存在於180種黴漿菌株，但不存在於真核細胞。利用偵測酵素的存在與否，可以提供高敏感度的快速篩選流程，偵測樣品中的低濃度的黴漿菌。

(1)試驗原理:

活的黴漿菌溶離後，內部酵素會與試劑基質產生反應，催化酵素中的ADP變成ATP。因此藉由測量樣品加入試劑前後ATP的濃度，計算比值就可以獲得黴漿菌存在或不存在的測試指標。如果沒有黴漿菌的存在，冷光讀值不會增加，否則便會有更高的光量表現，請見下圖。

(2)優點:

比對黴漿菌快速冷光偵測法與傳統的測試方法，前者有一致性的準確度，優於PCR測試方法(見表一)，且偵測時間僅約需20分鐘時間。目前已測試過柔膜細菌綱(Mollicutes)裡的44種mollicutes(內含6種最常見的細胞培養汙染菌株)，分別來自人類、牛、豬、羊、犬、鼠科、鳥類、昆蟲和植物，黴漿菌快速偵測試劑都可以檢查出黴漿菌的感染。

三、第九共研單試管冷光儀簡介

單試管冷光儀可用於測試生物性及化學性冷光，內建黴漿菌測試試驗專用模組，並可以用於其他冷光條件的試驗，例如細胞增生、毒性試驗，或是報導基因(Reporter Gene)冷光試驗。

(一)使用特性:

1. 內建兩種基本的測量模組

2. 高靈敏度和線性，可以偵測至少50 attomol ATP，或小於1,000冷光酵素分子(報導基因冷光試驗），動態範圍可以到達5.5個能量光域值

3. 偵測光譜範圍: 300~600nm

(二)實驗步驟:

四、結語

在歐洲細胞庫(ECACC)中明確指出，黴漿菌測試比細菌和真菌汙染更隱密且難偵測，需要專門且常態的偵測。美國國立衛生研究院(NIH)在一封公開信中更說明，實驗室應遵守細胞培養良好規範(GCCP)指南，包括引入細胞株時就需要建立黴漿菌的檢測，接著才進行常態測試，因此快速簡易的黴漿菌偵測法的建立將可提升實驗室細胞培養的效率，歡迎大家踴躍使用第九共研提供的黴漿菌偵測服務。

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