醫學研究部(Department
of Medical Research)共 同 研 究 室 電 子 報
第二十期 Aug.10.2015
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軟體FLOWJO
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“Since we got the device, it has been running non-stop”
Dr Robert Gillies, H.Lee Moffitt cancer center in Tampa, Florida
摘錄自
Nature;2013 Feb 7.494(7435):133-136
近幾年，隨著海馬生物能量儀進入市場銷售，粒線體及能量代謝相關研究猶如雨後春筍般地成長。共同研究室期許提升研究動能並能跟進國際趨勢，在今年購置此測定儀。本期的電子報將主要概述海馬生物能量儀的原理和應用，第二部份的新知將著重於該儀器如何作為個人化醫療健康偵測指標。下一期電子報將介紹流式細胞儀分析軟體FLOWJO，有軟體需求的同仁請密切注意下期的電子報喔!並竭誠歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器介紹、研究新知與每月訓練課程。更歡迎您與我們聯絡，給予我們建議與鼓勵。
本期電子報介紹之海馬生物能量儀已於七月份購入開放申請使用，為了提供使用者完善的服務，本儀器提供免費上機協助，請上機前與管理人員聯絡。因七月份舉辦的海馬生物能量儀訓練課程，人數超過報名限額。若無法參與，仍有儀器使用需求者，請洽管理人員觀看錄影課程。另本月份「臺大醫學校區學術演講及研討會公告平台」有多場精彩演講及課程，歡迎同仁踴躍發佈訊息並查詢利用。
感謝共同研究室使用者長期支持與使用，我們一直致力於提供更優質的設施與服務，共同研究室儀器網路預約系統已升級上線嘍，包含流式細胞分析暨分選核心服務(FACS
Core)及LSRII自行操作部份，可全天候二十四小時開放。不分院內外，預約e指通，歡迎同仁多加使用。共研其他儀器設施陸續建置中，感謝您的耐心等待。希望我們所提供的設備對您的研究有所助益，服務品質也令您滿意，為了共研長期的經營運作，請您於發表文章時惠予致謝共同研究室，作為服務成效評鑑之用。
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一、海馬生物能量代謝測定儀原理介紹
美國Searhose Bioscience所生產的海馬生物能量代謝測定儀XFe analyzer (內文後續簡稱海馬生物能量儀)為全球唯一可評估活體樣本整體能量代謝的平台；生物能量的概念就是ATP，所以此平台同時偵測唯二會產生ATP的系統：粒線體及糖解作用(圖一)。加上可同時偵測多個樣本(96 well, 24 well or 6 well)，還有可設定時間與順序的自動注藥系統等功能，讓能量代謝在這幾年變成火紅的熱門研究主題！
細胞要活著才有能量，因此進行偵測時細胞必須要活著且狀況良好，因此螢光標定或是溶解細胞偵測內含物等方式都不適用，也因此傳統並無一個有效率偵測能量代謝的工具。海馬生物能量儀的獨家專利偵測方式採用全新的概念，藉由偵測細胞周圍微環境的變化來評估能量代謝；由於粒線體氧化磷酸化反應會消耗氧氣，糖解作用會產生乳酸排出細胞外解離出氫離子，因此同時偵測細胞周圍環境的氧氣消耗率以及產酸率就可達到不接觸不傷害樣本而可偵測整體能量代謝的目標。
圖一 粒線體呼吸作用(Mitochondrial Respiration)及糖解作用(Glycolysis)
儀器主要偵測原理是藉由該公司所生產的特殊螢光微孔盤，每個Well的探針都有兩種螢光材料可分別與O2或H+做可逆式的結合，當以相對應的光源去激發時會因與O2或H+結合的多寡而有不同強度的放射光回饋到儀器的偵測器;當螢光探針下降到底部時就可製造固定空間大小的微環境(圖二)，加速細胞的耗氧與產酸效率，此時儀器就會連續偵測螢光訊號的變化及後續軟體運算來推估耗氧率及產酸率，即OCR(Oxygen Consumption Rate)與ECAR(Extra Cellular Acidification Rate)。
圖二. 偵測盤微環境示意圖
基於以上的基礎，海馬生物能量儀可以穩定並再現多樣本的實驗結果；由於能量代謝系統平時並不會以極限狀況運作，因此若希望將樣本間的差異放大，該公司有建議的實驗設計提供給研究人員用以評估粒線體或糖解作用的極限運作能力，例如: XF Cell Mito Stress Test 和XF Glycolysis Stress Test (圖三a和圖三b)。
圖三a.
XF Cell Mito Stress Test
起始先偵測基礎的耗氧狀況，先加入ATP
synthease inhibitor抑制粒線體產生ATP，被抑制的耗氧量就表示有多少氧氣參與合成ATP，接著加入FCCP，此藥物為uncopular在適當的濃度可不破壞電子傳遞鏈而讓粒線體以極限狀況空轉，用以評估粒線體的最大耗氧能力，最後加入電子傳遞鏈的抑制劑Complex
I inhibitor Rotenone & complex III inhibitor Antimycin A，將粒線體的耗氧完全關閉，確定其偵測的背景值。
圖三b.
XF Glycolysis Stress Test
上機前須先將培養基更換為no
glucose medium 30 min，將細胞內的glucose消耗完，因此一開始偵測時ECAR數值會很低，因為沒有glucose可進行glycolysis；首先加入10
mM glucose，評估樣本在環境突然給與足夠養分時將之轉換的效率，接著加入oligomycin關閉粒線體的ATP供應，評估當糖解作用為唯一ATP來源時的表現狀況，最後加入2-DeoxyGlucose來競爭glucose以確定糖解作用的背景值。
研究人員除了可以導入自己的細胞平台，還可以偵測動物的各式活體組織、斑馬魚胚胎、線蟲、酵母菌、植物、細菌或精子等活體樣本，輔以基因或蛋白表現的調整，或是不同養分、藥物、毒物、nanoparticle、hypoxia等處理對細胞的影響，幾乎可以適用在各個研究領域，目前已有1800多篇文獻藉由海馬生物能量儀來分析各研究領域和能量代謝之間的問題。若研究人員目前已有建立完整的細胞實驗平台，該儀器可以很輕易的與現有的研究做結合，協助其探索更深入的現象。
二、使用說明
目前「海馬生物能量儀」位於第七共同研究室，若有需要接受訓練課程和預約使用，請洽詢儀器管理人員袁惠萍小姐，分機:63162，電子信箱 hpyuan@ntuh.gov.tw。若有任何問題，歡迎來電或來信討論。
Bioenergetic Healthy Index:個人化醫療的新世代健康偵測指標
尚博生物科技有限公司
周家豪先生
“能量代謝”極有潛力成為了解現代文明病的起因，例如：神經退化性疾病、糖尿病、癌症與心血管疾病的致病機轉、研發治療策略與疾病進程監控的生物標記；關鍵的概念是粒線體可做為“礦坑裡的金絲雀”，於早期代謝就發現粒線體出問題時，監控病人早期能量代謝轉變，可以提早並敏感地得知病情的嚴重性。又因免疫細胞直接暴露在各式養分、代謝物與免疫刺激物中，所以偵測周邊血的免疫細胞可做為偵測人體健康狀況的生物性指標。事實上，監控血液或患部體液的白血球能量代謝已成為轉譯醫學中評估粒線體功能的重要方法，並可做為個人化醫療的參數依據。
BHI的概念是建立在美國Seahorse Bioscience所生產的海馬生物能量儀XFe analyzer，此為全球唯一可穩定地偵測多樣本能量代謝(粒線體與糖解作用)，並自動注藥之系統，從2009年發售至今2015年全球已發表超過1800篇期刊，其中並有28篇Nature、31篇Cell與2篇Science，並為全球各大藥廠如pfizer, GSK, Novartis用於早期藥物開法與毒性評估。
2014年五月美國阿拉巴馬州伯明罕大學的教授Victor M. Darley-Usmar [1]提出使用XF mito stress test (如圖四)的參數計算出BHI= [ATP Production x Spare Capacity] /[Proton Leak x Non-Mito Respiration]。
圖四 Bioenergetic Healthy Index Formula
此公式的概念便是將表示粒線體好的參數置於分子，不好的參數置於分母，藉由相乘與相除將粒線體功能好壞的差異放大，這個演算方法對於樣本差異甚微的臨床樣本有很好的效果。
細胞的冷凍保存是目前全球生物產業界非常普遍的服務項目，但細胞經冷凍保存後解凍其生物能量代謝與保存時間的相關性則尚未明瞭。澳洲的研究團隊[2]募集8位身體素質相近男女各半的自願者們，從周邊血分離PBMC以液態氮保存，再依標準流程於不同時間點解凍後使用海馬偵測其BHI，各組粒線體功能指數於冷凍保存1個月後有明顯的下降，不過BHI的呈現會將此差異放大，因此於初期就有明顯的差異(圖五)。
圖五 解凍後周邊血球細胞的粒線體指數變化
腎臟病在全球影響超過一億的人口，英國研究團隊評估是否可用粒線體功能作為指標來評估正常人(Healthy Control, HC)、非腎臟疾病之糖尿病患者(diabetes patients without kidney disease, DC)和糖尿病腎病患者(diabetic nephropathy, DN)之間的差異[3]。將參與研究的試驗者抽血並分離出PBMC後，使用海馬測量並比較其BHI。
圖六 糖尿病病人與正常人之PBMC粒線體功能比較
實驗結果(圖六)於Maximal Respiration的部分，DN組明顯較差；DN組的BHI數值3.0，較HC (正常人)的3.4低。額外地進行能量代謝的彈性評估，藉由立即性注入20mM 高濃度Glucose來觀察細胞的耐受性。HC於立即注入glucose並無太大影響，但DN在注入glucose後其Max Respiration明顯降低，顯示細胞在能量代謝上沒有額外的彈性可以承受外來的壓力與變化 (圖七)。此研究結果證實粒線體功能可以評估腎臟功能，並可以BHI作為標準的量化指標。
圖七 能量代謝能力評估 (Red：medium only; Blue：high con. glucose)
除了PBMC之外，若能夠取得更貼近患部的免疫細胞將可更真實的反應粒線體的功能是否有受到影響；Victor M. Darley-Usmar教授研究團隊透過評估10位正常人的PBMC與8位病人在心臟手術後的PBMC與心包膜液內分離出的monocyte來使用海馬生物能量儀來評估BHI [4]。實驗結果(圖八) 顯示Healthy Control與Post-op Blood在mito stress test的藥物注入後在各階段都僅有些微差異，如ATP production減少、Max Respiration減少和non-mito respiration增加等，若以BHI計算則有顯著差異；若是心包膜液的monocytes差異則變得更加明顯，於mito stress test的起始basal respiration就明顯低許多，因為實驗結果已經用蛋白質定量校正過，所以可直接做正確的比較，而這樣的結果也符合實驗團隊認為心臟手術會因氧化壓力而使得粒線體功能受損的假設。
圖八 心臟手術前後PBMC粒線體功能之變化
“海馬生物能量代謝測定儀”讓細胞的能量代謝變成可以穩定重複產出的研究數據，讓能量代謝可以無障礙的與各研究領結合；細胞的活動皆須要能量，能量更是連結genomic, proteomic與 cell function之間的重要橋樑；此儀器不但提供一個全新的視野來協助現有的轉譯醫學和臨床研究，同時也為研究人員注入新的能量！
參考文獻：
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The Bioenergetic Health Index: a new concept in mitochondrial translational research. Chacko B K, Kramer P A, Ravi S, Benavides G A, Mitchell T, Dranka B P, Ferrick D, Singal A K, Ballinger S W, Bailey S M, Hardy R W, Zhang J, Zhi D and Darley-Usmar V M. Clin Sci (Lond); 2014, 127:367-373.
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The Impact of Cryopreservation on Human Peripheral Blood Leukocyte Bioenergetics. Keane KN, Calton EK, Cruzat VF, Soares MJ and Newsholme P. Clin Sci (Lond). 2015, 128:723-33.
-
Altered mitochondrial function, mitochondrial DNA and reduced metabolic flexibility in patients with diabetic nephropathy. Anna Czajka, Saima Ajaz, Luigi Gnudi, Chandani Kiran Parsade, Peter Jones, Fiona Reid, Afshan N.Malik. EBioMedicine. 2015,2:499-512.
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Decreased Bioenergetic Health Index in monocytes isolated from the pericardial fluid and blood of post-operative cardiac surgery patients.P. A. Kramer, B. K. Chacko, D. J. George, D. Zhi, C.-C. Wei, L. J. Dell'Italia, S. J. Melby, J. F. George and V. Darley-Usmar. Bioscience Reports.2015.
儀器訓練課程:課程網路報名
| 06月26日 | 儀器訓練課程--螢光顯微鏡暨影像擷取系統（NIKON E400 & TS-100） |
研究新知課程:課程網路報名
| 08月11日 | Introducing High-Resolution and Advances in Super-Resolution Imaging Technologies to See Biology in Higher Definition |
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