醫學研究部(Department
of Medical Research)共 同 研 究 室 電 子 報
第十三期 JAN.10.2015
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新年快樂!今年的共同研究室將給各位不一樣的體驗，共同研究室的核心服務將推出線上預約系統喔!本期的電子報將概略介紹研究分子診斷中重要的工具:即時聚合連鎖反應器。此外，使用即時聚合酶連鎖反應器時，時常會外加一種染劑RoxTM，針對這個染劑的優點，在本刊的第二部分會有詳細的介紹。下一期電子報另介紹MED64單根電極影像系統&微需氧培養箱，有儀器需求的同仁請密切注意下期的電子報喔！歡迎您訂閱共同研究室電子報以獲得相關訊息。同仁對於共同研究室如有其他新的研究服務需求，更歡迎您與我們聯絡，給我們建議與鼓勵。
感謝共同研究室使用者長期支持與使用，我們一直致力於提供更優質的設施與服務，近期共同研究室流式細胞分析暨分選核心服務(Cell Sorter)將推出全新網路預約系統，不分院內外，預約e指通，敬請同仁留意相關公告。
共研其他儀器設施陸續建置中，感謝您的耐心等待。希望我們所提供的設備對您的研究有所助益，服務品質也令您滿意，為了共研長期的經營運作，請您於發表文章時惠予致謝共同研究室，作為服務成效評鑑之用。
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一、原理簡介
在即時聚合酶連鎖反應器發展之前，分子生物學主要以end-point PCR為主:利用thermo cycles 特定溫度重複加熱，使特定引子primer 可以黏上target gene，再加上轉錄酶作用，將目標基因的DNA片段以2的指數增幅放大。最後，再利用洋菜膠電泳 (agarose gel electrophoresis)進行結果分析。
直到即時聚合酶連鎖反應器出現，在特殊的光學系統偵測下，配合原來的thermo cycles (PCR cycle)和特別螢光物質，反應中產物量的變化得以被紀錄和分析。PCR 反應的最佳效能，DNA產物是以 2n 進行擴增。特殊螢光物質(例如: SYBR Green I) 可以結合到''雙股DNA''，因此PCR產物隨著PCR cycle數呈正相關增加(如圖一)。但是實際上，初期的反應因為 DNA 樣本數濃度低，故無法達到此理論值。而後期的反應，因為酵素和特定primer 耗盡等因素，偵測到的螢光量變化趨於平緩。換言之，整個 PCR 反應只有中段的部分是以2n進行反應。
對於同一種基因產物，兩個樣本具有不同copy number的DNA，在相同的PCR反應下，較少的PCR cycle數目即可擴增至設定的螢光閥值(Threshold )，表示來源DNA含有該基因量較高。反應器會紀錄PCR cycle 與生成產物的相對關係，先選定螢光量變化圖中段的閥值，再對應至曲線的cycle數 (Ct值)，即可推算target基因量在不同樣本的倍數關係(如圖二)。
圖一 圖二
在探討細胞基因表達的層次上，mRNA表現量往往被當為主要的指標，藉由mRNA經反轉錄成為cDNA後，再透過即時聚合連鎖反應器來分析 PCR cycle 與生成產物的相對關係，來推算特定基因的表現量。也因為快速的特性，再加上高敏感度和專一性高，即時聚合酶連鎖反應器成為分子研究與診斷中不可或缺的工具。
此外，即時聚合酶連鎖反應器也可應用在絕對定量DNA。使用已知DNA濃度標準品在即時聚合 酶連鎖反應器執行PCR cycle，由螢光量變化建立標準曲線，再進一步將待測樣本所偵測之螢光量由內插法來推算該樣本的DNA濃度。
有別於SYBR Green屬於非專一性偵測，另外的偵測方法是合成TaqMan probe、Molecular Beacon等專一性的螢光探針(probe)和引子(primer)，再利用即時聚合酶連鎖反應器來偵測並記錄螢光變化，除了相對定量(Relative Quantification)和絕對定量(Absolute Quantification )，該儀器也可以執行SNP genotype、Plus/minus assay、microRNA等分析。
目前共同研究室共有三台即時聚合酶連鎖反應器，其功能比較表如下:
| 共研別 | 三共 | 七共 | 七共 |
| 中文名稱 | 即時聚合酶連鎖反應器 | 溫度梯度核酸即時定量PCR | |
| 廠牌/型號 | ABI/ 7900HT |
ABI/ 7900HT Fast system |
Bio-rad/ MyiQ |
| 上機孔盤 | 96 well |
96 well TaqMan® Low Density Array |
96 well/八連排 (可設定梯度溫度) |
| 上機時間 | Standard program:約2小時 |
Standard program:約2小時 Fast program:約40分鐘 |
約2小時 |
| 光源/偵測波長 | 488 nM (argon-ion laser)/ 500~660nm | 475-495nM (Tungsten-Halogen Lamp)/515-545nm | |
| 適用方法 | SYBR, Primer-Probe Detection | SYBR Green I, FAM | |
| Software | SDS v2.2.2 | 上機:
SDS v2.3 分析: RQ manager |
MyiQ detection system |
|
使用費用 (自104.1.1修訂收費標準) |
100元/盤 | 100元/盤 | 60元/盤 |
二、儀器使用說明
目前「即時聚合 酶連鎖反應器」位於第三、第七共同研究室，歡迎同仁預約使用。儀器預約或諮詢請洽:第三共同研究室管理人員歐陽璞小姐，分機：65725，電子信箱uno5725@ntuh.gov.tw； 第七共同研究室管理人員袁惠萍小姐，分機：63162，電子信箱hpyuan@ntuh.gov.tw。若有任何問題，歡迎來電或來信討論。
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使用RoxTM的好處 : 確保您獲得均一的定量PCR實驗結果
萊富生命科技股份有限公司
某些不含有RoxTM 標準化的校正螢光，或是無法在整個實驗過程中使用校正螢光的定量PCR平台，常常試圖貶低使用校正螢光的價值。然而事實是，在定量PCR反應過程中RoxTM染劑是一項非常有價值的工具，能帶來以下多方面益處：
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校正單次反應過程中由於泡沫或蒸發/冷凝而導致的訊號改變;
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為故障分析提供一項強有力的診斷工具：每個cycle反應採集Rox染劑訊號，不受PCR反應影響;
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標準化校正由於移液誤差(Pipeting error)或蒸發所導致的同批內部體積差異；
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標準化校正批間體積差異，提供更連續一致的同批間重複的CT值。
RoxTM 校正單次反應運行中的訊號改變
在理想反應條件下，Reporter Dye的訊號值起始於基線，當反應體積中存在合適的目標序列分子時，Reporter Dye會隨著PCR反應的進行，產生出一條典型的擴增曲線，儀器軟體通過擴增曲線算結果。如果擴增曲線只是簡單地根據Reporter Dye的螢光訊號而繪製，將會難以區分樣品的真實差異和隨機反應條件帶來的人為差異。現實中，有許多事件可能影響Reporter Dye的表現：泡沫會在不同時間點形成螢光訊號尖峰；蒸發或冷凝會造成反應體積濃度改變，造成不同反應批次間螢光訊號值增強或減弱(見圖一)。這類可能發生的事件同時影響Reporter Dye和RoxTM校正螢光，因而使用AB的定量試劑與儀器時，根據Rn值繪製擴增曲線，採集的是Reporter Dye減去RoxTM 的螢光差值，任何潛在的人為誤差因素都被均一化，而排除在最終結果之外。
RoxTM 提供強大的故障分析工具
RoxTM 校正螢光作為故障分析工具的價值同樣不應被低估。如果一個反應失敗了，RoxTM 螢光在反應過程中應有持續不變的訊號標準。RoxTM 訊號可以提供反應設置的資訊提示：無RoxTM 訊號，很明確地代表沒有放置Master Mix試劑；異常大的訊號值強度差異，暗示可能放置了2倍反體積；RoxTM訊號不規則變化，暗示可能存在儀器故障。AB公司的技術支援在故障排除工作中總會使用RoxTM 螢光，來幫助在最短時間內獲得更多訊息的檢測結果。
RoxTM標準化反應體積差異:以下實驗資料證明RoxTM 螢光在校正移液誤差上的價值。
實驗一：RoxTM 標準化處理校正移液錯誤 (Pipeting Error)
透過系統地減少從RNase P Plate中移出的樣品，加入分子級純水補齊體積，來模擬移液錯誤對反應精確性的影響。圖三描繪了實驗中的原體積樣品，以及3個移液錯誤重複：分別含0.5, 1.0 和1.5μl 的 ddH2O(樣品體積相對減少)。資料分析時使用RoxTM校正初始濃度差異(由移液錯誤導致的)，得到的CT值SD(標準差)為0.075；而不使用RoxTM校正的CT值SD(標準差)為0.174(見圖二)。
實驗二：RoxTM標準化處理確保定量反應精確性
相似地，直接從RNAse P Plate中移出反應混合液進行重複實驗繪製標準曲線，比較使用RoxTM和不使用RoxTM分析時的精確性差異(見圖三)，結果R2值分別是0.997 和 0.99。當反應體積中部分樣品被1μl ddH2O替代，RoxTM均一化處理能夠校正此微小錯誤，而當分析不包含RoxTM校正時，各個標準組中很明顯地出現了更大的散佈(見圖四和表一)。
表一顯示了各個濃度重複樣品的結果標準差(SD)。其中，直接從RNAse P plate中移出反應混合液進行的重複實驗，使用RoxTM或不使用RoxTM所得的CT值SD(標準差)差異很小(平均小於0.04)。可是當模擬移液錯誤時，不使用RoxTM校正所得的CT值SD差異遠遠大於使用RoxTM校正時的結果(為後者的10倍後者)。以上結果再次證明了使用RoxTM校正螢光分析Real-Time PCR實驗資料時的優勢。
總之，以上實驗的體積錯誤只是任何實驗室Real-Time PCR平台在實際操作中可能遇到的諸多錯誤中的一個。考慮到這類錯誤在日常中常常會出現，再加上文中提到的其他與定量PCR平台相關的可能人為錯誤，顯而易見，分析Real-Time PCR資料時使用RoxTM標準化具有明顯的益處。
圖一、 Multicomponent Plot顯示RoxTM訊號和Reporter Dye訊號一同抬起，結果暗示存在蒸發狀況。
圖二、原始樣品與3種移液錯誤的樣品(分別用0.5, 1.0 和 1.5μl ddH2O替代等量樣品)的擴增曲線。使用RoxTM可以校正樣品起始體積(或濃度)的輕微差異(2A)，而不使用RoxTM時可以明顯看到輕微的散佈(2B)。
圖三、不同濃度點RNAse P 重複樣品的擴增曲線。資料分析時分別用RoxTM(3A)和不用RoxTM(3B)，結果表現都很好。
圖四、重複RNAse P 標準品，及模擬移液錯誤樣品(1μl反應混合液被ddH2O取代)，繪製擴增曲線。資料分析時分別使用RoxTM(4A)和不用RoxTM(4B)，證明RoxTM可以校正由輕微起始樣品濃度或反應體積錯誤而造成的差異。
表一、計算重複進行RNAse P 標準曲線實驗的標準差(SD)，將其與1μl反應混合液被ddH2O取代的實驗結果比較。使用RoxTM校正可有效減少錯誤。
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| 01月13日 | Quantifying Cell Behavior by Electric Cell – substrate Impedance Sensing |
研究新知課程:課程網路報名
| 01月06日 | Application of NGS in clinical cancer research: strategy and example | |
| 01月16日 | 使用標準化系統進行蛋白質表現定量分析 |
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為持續提供優質之研究服務，便於日後聘用專職技術人員、購置新儀器、現有儀器汰舊換新與維護保養等等，敬請於使用共同研究室資源並發表論文時，於論文致謝（Acknowledgement）處加入致謝共同研究室之文句，並於論文發表時通知共同研究室管理人員。致謝文句請依實際使用情形書寫，或請參考以下範例：We
thank the staff of the Core Labs, Department of Medical Research, National
Taiwan University Hospital for technical support.