孫金生物科技 林志勇博士

科學家長期以來採用連續切片與顯微鏡擷取方式，以獲取樣本內部的三維生物資訊，但缺點是此過程不僅耗時費力，且常發生因切片造成樣品破壞，而導致影像資訊遺漏的問題。近年來因透明化技術的成熟發展，樣本可免除繁瑣切片的過程，而直接進行其內部的細微形態結構觀察。本期電子報介紹生物組織透明化技術，期能讓讀者初步了解不同透明化技術以選擇最適合自己的研究方法。

透明化原理:

當光波通過折射率不一致的生物組織時，會導致光波在不同物質界面處產生折射，從而使波前的形狀出現失真，也就是光散射的現象。所以，將生物組織內部的折射率趨近一致化，即可呈現出透明的效果，再藉由配合如共軛焦顯微鏡與螢光標定等技術，可完整取得樣本內部清楚的3D影像。目前依透明化使用方式不同，大致分為2類，分別是有機溶劑型(solvent-based clearing)及水溶液型(aqueous-based clearing)。
　

一、有機溶劑型透明化技術:

有機溶劑處理過程中，固定後的樣品會再經過脫水處理，並置入高折射溶劑中浸泡進行透明化程序。常見的方法如BABB(Dodt et al.,2007)及DISCO系列(Cai et al.,2019;Erturk et al.,2012;Pan et al.,2016;Renier et al.,2014)，其優點在於操作容易及快速，適用於全器官或完整個體的透明化，但須注意溶劑的毒性與腐蝕性、樣品形變與體積萎縮、螢光蛋白訊號淬滅(quenching)、自發性螢光背景值(autofluorescence background)上升等不良影響。
　

二、水溶液型透明化技術:

水溶液方法可避免上述有機溶劑對實驗者或樣品帶來的不良影響。常見的水溶液技術可再細分為3類: 水凝膠式(Hydrogel embedding)、超水合式(Hyperhydration)、簡易式 (one-step clearing)。

 1.水凝膠式

史丹佛大學Diesseroth教授團隊於2013年創新發明CLARITY 技術(Chung et al.,2013)。樣品先透過多聚甲醛(Paraformaldehyde)、丙烯醯胺(Acrylamide)及蛋白質三者鍵結形成高分子生物水膠(hydrogel)，再經十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)移除細胞膜脂質，最後於高折射率水溶液進行透明化。其優點是透明效果佳、抗體可重複多次進行標定、可保存螢光蛋白訊號，亦可適用於全器官或完整個體的透明化。但此實驗過程複雜，初學者如欲自學進行，將較為困難。

 2.超水合式

運用高濃度的尿素與非離子型介面活性劑等對樣品進行變性(denature)與去脂化(delipidation)以提昇樣品的含水性，並同時降低樣品內折射率，是這類型技術的特色，以Scale(Hama et al.,2011)與CUBIC(Tainaka et al.,2014)為主要代表。操作簡便、良好的透明化效果以及可保存螢光蛋白訊號等，是這類方法的優點，適用於全器官或完整個體的透明化，但缺點是不能進行細胞膜染色實驗、樣品的體積會增加大約50%、有24%~41%蛋白質流失的風險，以及須長達3~4週的實驗時間，是使用此方法的困擾(Richardson and Lichtman, 2015)。

 3.簡易式

樣本只進行短暫的通透性處理(permeabilization)之後樣品即可直接浸泡於高折射率的水溶液內進行透明化，省去繁瑣的水膠化或去脂化等處理步驟是這類型技術的特色，SeeDB(Ke et al.,2013)、ClearT(Kuwajima et al.,2013)及RapiClear(Gomariz et al.,2018)等方法為主要代表。其操作流程安全、簡便、快速、可妥善保存螢光蛋白訊號、樣品不變形、可進行細胞膜染色實驗與抗體螢光標定等眾多優點，所以吸引許多科學家使用。

三、脫色干擾:

色素普遍存在生物樣本，例如:血紅蛋白(hemoglobin)，黑色素(melanin)和脂褐素(lipofuscin)等，因具有吸光與自發性螢光的特性，所以常會降低透明化樣本的螢光訊號品質(Tuchin,2015)。解決方法則可使用過氧化物(peroxides)、酸性丙酮(acid acetones)、強鹼基(strong bases)或Quadrol搭配銨溶液(ammonium solutions)等物質降低色素的干擾(Richardson and Lichtman, 2015)。

結語:

生物樣本透明化後所獲得的3D影像可進一步結合如轉錄體學(transcriptomics)、代謝體學(metabolomics)、或蛋白質體學(proteomics)等技術，對樣本於結構與功能上進行更客觀分析，所以，諸如測試治療方案與藥物開發等都可受益於透明化技術的應用。

　

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