醫學研究部蛋白質體核心團隊

瀚盟科技股份有限公司 賴若馨專員

隨著單細胞體學日益蓬勃，研究人員得以更深入地洞察組織中的細胞異質性，並進一步將這些見解轉化為具突破性與臨床應用潛力的分子標記。然而，由於蛋白質無法像核酸一樣被擴增，想在單一細胞中偵測極微量的蛋白質仍具相當挑戰，因此需要穩定的單細胞微量蛋白製備技術，以及超高靈敏度的質譜偵測設備 (見圖一)。以下將就這兩大關鍵技術做詳細介紹。

圖一、單細胞蛋白質體分析流程示意圖

單細胞微量蛋白製備技術

在單細胞蛋白質體學中，微量蛋白質樣本製備是首要步驟。除精準且溫和的細胞分選外，還需自動化的樣本製備流程，以避免傳統多步驟人工操作造成的蛋白樣本損耗。為此，Cellenion 公司採用高精度非接觸式分注技術，推出的 cellenONE X1 Neo 結合單細胞分選與自動化超微量分液功能，為單細胞微量蛋白製備提供全面解決方案 (見圖二)，也可應用於各類單細胞分析，包括單細胞轉錄體學、蛋白質體學及多體學等。其特色主要分為以下兩點：

圖二、cellenONE X1 Neo 實機照片與其主要特色優點

1. 高精準與多元化的單細胞分選

cellenONE 整合先進影像平台與高精密分液技術，能即時且高精度地進行單細胞分離與分選。此系統使用溫和的聲波產生液滴進行細胞分離，並在整個流程中維持適宜的溫溼度，最大程度地保留細胞存活率與活性，便利後續蛋白質體前處理。另外，系統內建高解析度光學元件，可採用可見光或多重螢光檢測，依據細胞大小、形狀等參數，從微量樣本中篩選多種類型的細胞 (見圖三A)；可視化影像功能則能確保分選之精準度 (見圖三B)，適用於哺乳動物細胞、植物細胞乃至細菌等各種大小的目標。經分離後的微量樣本也能回收再利用，使珍貴樣本得以用於更多後續研究 (見圖三C)。

圖三、cellenONE X1 Neo 支援高精準與多元化的單細胞分選。(A) 使用者可依據細胞大小、形狀、細胞表面蛋白或螢光標記等多項參數，自行設定條件以分選目標細胞。(B) 系統提供可視化的即時影像，且所有數據影像均可被儲存，方便後續回溯判讀與品質管控。(C) 若液滴中僅包含符合使用者設定參數的單一細胞，便會將該液滴收集至樣本孔盤；其餘無細胞、多細胞，或是在預設範圍前後均有細胞的液滴，則會被分配至回收瓶進行後續回收處理，避免珍貴樣本浪費。

2. 一站式微量蛋白質樣本製備

將分選出的目標細胞放置於微量多孔盤中，透過標準化的自動超微量分液器精準加入或抽取所需試劑 (見圖四A)，同時針對每個步驟進行適切的溫溼度調控，以完成蛋白萃取與胜肽樣本製備。此流程可在同一台設備上自單細胞分選一路到蛋白質前處理一站式完成，不僅提升樣本通量，也大幅降低蛋白損耗率 (見圖四B)。目前已能一次處理 500 個細胞並進行蛋白質的鑑定與定量，未來則將持續提升通量與偵測深度。

圖四、cellenONE X1 Neo 所提供的一站式微量蛋白質樣本製備技術。(A) 透過標準化的超微量分注技術，可自動且精準地加入或抽取所需微量試劑，減少因多步驟手動製備而造成的樣本損耗。(B) 從單細胞分選到蛋白質樣本前處理皆可在同一平台上完成所有操作。

與流式細胞儀（FACS）相比，cellenONE 的細胞分選技術更為溫和，且能達到近乎 100% 的高精準分選率；同時，分選過程可完整保留影像做後續判讀與品管。此外，cellenONE 兼具蛋白質樣本前處理多功能優勢，可避免多步驟手動製備而導致的樣本損耗。經由此設備得到的微量蛋白樣本接著進行液相層析及質譜分析，因此能夠分析超微量、低豐度的單細胞蛋白質樣本的高靈敏度質譜儀，便成為後端不可或缺的核心設備。

超高靈敏度的質譜偵測設備

過去質譜分析多仰賴滯留時間（Retention time, RT）、質荷比（m/z）和 MS/MS 圖譜這三個維度作為鑑定參數；但 Bruker 公司的捕集型離子遷移率（Trapped Ion Mobility Spectrometry, TIMS）技術，則進一步提供第四維 CCS（collision cross section）參數以提升分辨度。此技術在帶電場與氣體的環境中，依據離子形狀產生不同飛行速度來分離母離子，並經碰撞碎裂成子離子後，再由飛行時間式（Time of Flight, TOF）分析器偵測，離子利用率可達近乎 100%（見圖五A）。藉由 4D-Proteomics 方法，能獲得更深層的蛋白質體資訊，同時維持卓越的靈敏度與穩定性，使極微量的單細胞蛋白質樣本也能被準確分析。

自 2017 年推出第一代搭載 TIMS 技術的機種以來，該技術持續演進，現已針對單細胞微量樣本開發至第三代 Ultra 2。此新一代機種從微量進樣進一步支援常態進樣，寬廣的進樣範圍讓使用者得以安心分析珍貴且無法準確預估濃度的樣本 (見圖五B)。與前兩代機種相比，第三代 Ultra 2 在單細胞樣本中可鑑定到更多母離子與蛋白質 (見圖五C)，使研究者能更全面地洞察細胞異質性，並進一步探索病灶微環境中不同細胞的差異與調控機制，不再侷限於只看到混合平均值的蛋白質表現。

圖五、TIMS 的核心構造、系列機種與分析表現。(A) 在 TIMS 核心結構中，離子受到氣流推動並穿過分析器，於減速電場下（綠色框線）進行離子累積。隨著電場作用力的逐步減弱，離子會根據自身遷移率的高低而陸續被釋放（紅色框線），達成分離的目的；釋放後的斷片離子則經由 CID 碰撞解離後進入 TOF 分析器進行偵測。(B) 自 2017 年推出 timsTOF Pro 以來，TIMS 技術逐漸演進至多種機型，其中 timsTOF Ultra 2 的進樣範圍可涵蓋從胞器、單細胞層級到一般常態分析，是分析挑戰性樣本的最佳選擇。(C) 使用 Bruker 以 TIMS 技術開發的三代機型，分別比較單細胞層級分析時可鑑定出的母離子數量與蛋白質數目，可明顯看出最新機型Ultra 2在單細胞分析領域的優勢。

德國知名質譜學家 Matthias Mann 教授率先利用 cellenONE 進行單細胞分離與蛋白質樣本前處理，並串接高通量的 Evosep ONE LC 與 Bruker 獨有的 TIMS 技術，進行單細胞微量蛋白質的 4D-Proteomics 分析（見圖六A），可於每個細胞中鑑定約 2000 種蛋白質。藉由此工作平台，單細胞生物學的研究視野已能從基因體學、轉錄體學進一步拓展至定量 4D 蛋白質體學 [1]。

在 2024 年，研究團隊進一步突破了「需逐一分析每個單細胞」的侷限，將 cellenONE 專用耗材（proteoCHIP 12×16）與化學質譜標記技術相結合，開發出全新的多重標記單細胞蛋白質體分析方法（見圖六B）。此方法可同時處理多達 192 個細胞，單次分析便可偵測多達 1500 種蛋白質，不僅達到前所未有的高靈敏度，也大幅提升了分析通量與速度 [2]。

圖六、採用 cellenONE 串接 timsTOF 系列儀器的單細胞蛋白質體分析流程示意圖。(A) 首先以 cellenONE 進行單細胞分離並將蛋白質降解為胜肽，接著將單細胞胜肽樣本轉移至高通量液相層析系統 Evosep ONE 以去除鹽類干擾。該系統每天最多可處理 120 個樣本，最後再將經 Evotips 吸取的樣本導入 timsTOF SCP 質譜儀進行分析。(B) 利用 cellenONE 將單細胞分選至新開發的 proteoCHIP 12×16 微小孔槽中，並透過自動連續分注對每組 16 個單細胞進行化學標記。隨後，藉由離心方式將各組樣本集中到 proteoCHIP 漏斗的固定架，並透過自動進樣器直接將樣本送入 LC-MS 系統，進行單細胞蛋白質的鑑定與定量。

總結來說，一站式自動化處理單細胞分選與蛋白質前處理，可大幅降低蛋白損耗並提高通量；搭配超高靈敏質譜偵測平台，更能精準分析微量、低豐度的蛋白樣本，在單細胞層級展現前所未有的深度。隨著蛋白質體分析技術不斷進步，單次分析將可涵蓋更多細胞並偵測更多蛋白質，進一步推動單細胞蛋白質體學於臨床與基礎研究的應用。蛋白質體核心也將持續關注此創新技術，為院內研究人員提供更全面、多元的單細胞體學分析服務(諮詢分機263371)。

參考文獻

1. Journal of proteome research, 14(12), 5378–5387. DOI: 10.1021/acs.jproteome.5b00932.

2. Nature communications, 15(1), 5707. DOI: 10.1038/s41467-024-49651-w.

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