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共 同 研 究 室 電 子 報 第130期 Oct.10.2024 |
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組織解離
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Axion Biosystems推出的高通量細胞電位脈絡分析系統 (Maestro Pro & Edge) 讓電生理實驗不再困難,只要將(A)神經細胞/組織或(B)心肌細胞/組織 貼附在多孔微電極盤上,即可放入儀器進行偵測,能夠提供高效率的數據產出且結果相類似於傳統電生理數據,亦可搭配(C)LUMOS多孔盤光刺激系統執行光遺傳學的應用。 此外,亦可擴充(D)電阻抗偵測模組,針對所有種類的細胞 即時追蹤細胞增生、細胞型態及細胞存活率等變化,顯著降低實驗人力,不再需要擔心錯過重要的時間點。下一期電子報主題為[組織解離],敬請期待,並竭誠歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器介紹、研究新知、與每月訓練課程資訊,更歡迎您與我們聯絡,給予我們建議與鼓勵。
尚博科技生物有限公司 韋登元 技術主任 微電極陣列(Microelectrode array, MEA, 圖一)
Axion Biosystems的多孔微電極盤底部鑲嵌網格狀的電極陣列,如上圖。可以在電極上培養神經/心肌等可興奮性細胞,他們會逐漸成熟並形成網絡,最終產生網路功能。這樣多孔微電極盤上每個電極就可以捕捉到毫秒級的神經元自發放電或心肌細胞自發博動。 全球最先進的多孔微電極陣列系統 透過無標記、非侵入性的細胞外微電壓檢測技術,將多達768個高密度微電極陣列與多孔培養盤結合,提供即時且高通量的偵測平台,可以快速紀錄亦或長期監控活細胞的網絡電位活動或細胞間連動反應;儀器本身即搭載溫控與氣體控制系統,如同小型培養箱,讓長時間培養與偵測相當穩定。 本系統對於神經細胞和心肌細胞的功能檢測、藥物開發、疾病模式建立及幹細胞研究等應用是個極有效益的工具!
圖二為Maestro Edge儀器外觀,具備整合式的細胞環境控制艙;圖三為軟體即時分析活細胞顯示的電位活動。 A.神經細胞/組織-電生理偵測 三個層面了解神經網絡功能 高通量細胞電位脈絡分析儀可以記錄神經細胞產生的電訊號,包含電位活動(Activity)、同步性(Synchrony)和網絡震盪(Oscillation)。神經的電位活動(Activity)是以Spike方式呈現,也能稱為Firing。軟體會將這些收集到的訊號以柵狀圖的方式呈現,單位時間內一次產生許多Spike,我們稱為Burst。多個電極就能提供神經網絡的訊息,就能檢測到不同神經元同步放電(Synchrony)以及產生規律的網絡震盪(Oscillation)訊號。
圖四顯示神經細胞(橙色)經培養覆蓋於微孔盤底的微電極(灰色)上,可即時偵測細胞群落的電位活動。 神經科學應用 1.篩選具有神經毒性之化合物(1): 該文獻主要是利用iPSC來源的神經細胞來測試不同化合物對於神經發展毒性的影響,圖五是利用Maestro平台觀察記錄7-35天神經網絡的發展,可以發現隨著時間,神經細胞的平均放電頻率(MFR)、神經瞬爆持續時間(Burst duration)以及代表神經網絡和同步性等相關訊號也隨之增加。
作者利用此平台來測試28種化合物對神經網絡發展的濃度依賴效應(concentration-dependent effects),並將其會影響神經參數50%以上變化的濃度整理成圖六。
2.疾病模型建立(2)-巴金森氏病 (Parkinson's disease) 作者使用同卵雙胞胎的iPSC來建立巴金森氏病病模型。其中有一位雙胞胎有發病,而另一位沒有,取得他們的纖維母細胞後,將其誘導成iPSC,接著再分化成多巴胺神經元(dopaminergic neuron)。利用Maestro平台評估功能活動和網絡形成的差異,結果顯示如圖七與雙胞胎中未發病的神經元相比,發病的神經元在自發活動和成熟神經表型的發展上均有延遲的現象。
B.心肌細胞/組織-電生理偵測: 四項心肌細胞功能檢測 高通量細胞電位脈絡分析儀可以監測心臟功能性活動的四個主要方面(圖八),場電位(Field Potential)、動作電位(Action Potential)、傳導(Propagation)和收縮(Contractility)。
可以得到心肌活動的重要參數(圖九),去極化(Depolarization)、再極化(Repolarization)、跳動時長(Beat timing)和心律不整(Arrhythmias)等。
心肌科學應用 1.藥物安全評估(3) CiPA (the Comprehensive In Vitro Proarrhythmia Assay)是由美國FDA, HESI,CSRC等機構所提出的臨床前藥物心臟安全評估的新建議。在CiPA的先導實驗中,有6個核心實驗室使用Maestro平台來進行驗證。使用兩種不同來源的心肌細胞(由Axiogeneis和CDI公司提供)和8種已知藥理機制的藥物,進行盲測實驗。如下圖所示,在使用不同來源細胞、於不同實驗地點執行的實驗,其結果呈現高度的再現性。對於重要的參數變化,如hERG阻斷劑導致的FPD延長、Ca2+阻斷劑導致的FPD縮短以及Na+阻斷劑導致的脈衝震幅減小,都能精準的測量(圖十)。
2.幹細胞分化研究(4) 本研究的目的是使用Maestro平台對不同分化階段(1、2、4週)的iPSC來源的心肌細胞進行電生理功能的評估。結果顯示,分化四週的心肌细胞對比分化一週的心肌細胞有著更好的同步性(由場電位時長、跳動週期、傳播延遲等參數反應,圖十一)。
C.LUMOS多孔盤光刺激系統: 作為第一款商業化的高通量光遺傳刺激系統,Lumos可以同時進行光強度(1-100%)和光照時間(低至100ms)的調控。在每個微孔內,可以自行預先設定四種不同波長光線在時間軸上的操作模式,或者進行即時手動操作,使研究人員得以真正彈性有效地調控體外功能性細胞的網絡,並且詳細記錄數據 (圖十二)。
使用Maestro平台配合光刺激系統 (圖十三),即可用光來控制細胞電位活動,執行光遺傳學的研究,例如,利用基因工程方法使標的細胞可以表達光敏通道蛋白(如ChR2, channelrhodopsin-2)。而此光敏通道蛋白被特定波長的光刺激後,就能被激活,改變細胞膜電位,進而產生動作電位(5)。
左圖為Lumos光刺激系統儀器與底座的外觀;右圖為準備使用光刺激系統於Maestro平台上執行光刺激實驗。 D.電阻抗偵測模組 高通量細胞電位脈絡分析儀可以擴充電阻偵測模組,即時追蹤細胞增生、細胞型態及細胞存活率等變化,可應用於細胞毒殺試驗、癌症免疫研究、細胞訊號傳遞、病毒相關實驗和細胞屏障功能評估。 電阻抗偵測原理 每個 CytoView-Z 96 孔培養盤的孔內均嵌入電極,如圖十四。將細胞種植於這些電極上,通過測量電阻抗值(ohms, Ω)的變化,可以評估細胞的生長、形態變化、及存活率等現象,也可於中間透明區域觀察細胞生長情況。
當(1)在細胞未貼附的情況下,電阻抗值較低;(2)細胞開始生長並覆蓋電極,導致電阻抗值上升;(3)當細胞完全覆蓋整個電極時,電阻抗值就不會持續增加。加入藥物後,(4)部分細胞開始死亡並從電極上脫落,導致電阻抗值開始下降 (圖十五)。
應用 1.細胞毒殺試驗(6) 傳統的終點分析評估藥物細胞毒殺只能針對單一時間點,而難以觀察毒殺完整過程。透過電阻抗分析,能夠進行即時的測量,不僅能捕捉細胞的死活狀態,還能觀察細胞毒殺的動態變化及細胞死亡速度。這些數據能夠詳細推斷藥物作用的機制。亦可應用在癌症免疫細胞毒殺試驗 (圖十六)。
圖十六: A圖: 種植A549細胞,在24小時後添加了各種藥物(DMSO、Doxorubicin、Tergazyme),並觀察電阻抗值的變化;B圖: 顯示藥物處理30小時後的電阻抗值;C圖: 1 μM Doxorubicin的作用下,50% 細胞毒殺時間(Kill Time 50%)約為 31 小時。 2.細胞屏障功能(Trans-Epithelial Electrical Resistance, TEER)評估(7) 上皮細胞和內皮細胞在身體中形成屏障。這些屏障的強度和完整性可以通過測量細胞層之間的電阻抗來評估,稱為 TEER (圖十七)。可以透過不同頻率下的電阻抗測量來觀察細胞貼覆率和TEER的變化。在低頻率下測量電阻抗對於由細胞間緊密連接形成的屏障具有高度的靈敏性。另一方面,高頻率則適合用來評估細胞貼附的狀況。
圖十七: A圖: 培養盤孔內的電極測量細胞的貼覆率和TEER;B圖: 在高頻率測量下,Calu-3和 A549肺上皮細胞的貼覆率隨時間增加;C圖: 然而在低頻率測量下,只有表達 tight junctions 的 Calu-3 細胞展現出顯著的 TEER 訊號。 Axion BioSystems 的 Maestro MEA系統能夠即時、無標記監測、高通量評估可興奮性細胞,透過捕捉整個細胞群落的電位活動,更能貼近細胞實際的功能。它還提供基於電阻抗的細胞分析,可應用於各類型的細胞,這種連續數據收集方式,增強對細胞交互作用和藥物反應的理解,無需重複執行多次終點分析。
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