醫學研究部共同研究室

又到歲末年終，共同研究室祝福各位同仁聖誕及新年佳節愉快。共同研究室電子報發刊將屆滿週年，希望這一年來本電子報內容對同仁的研究有所助益並歡迎大家隨時回顧已發刊之各期電子報內容。西方墨點法（western blotting）是生命科學研究中常用以檢測蛋白質表現的實驗方法，本期介紹的螢冷光影像擷取分析系統是可取代傳統底片而用數位光電感應器(CCD)進行影像擷取，以獲得更精確的實驗結果。此外關於科學新知，我們也對快速定量細胞蛋白表現(In-Cell Westernä )之新研究方法做一個概括性介紹。下一期電子報將介紹即時聚合酶鏈鎖反應（Real-time polymerase chain reaction），有興趣的同仁請密切注意下期的電子報喔！歡迎您訂閱共同研究室電子報以獲得相關訊息。同仁對於共同研究室如有其他新的研究服務需求，更歡迎您與我們聯絡，給我們建議與鼓勵。

感謝共同研究室使用者長期支持與使用，我們一直致力於提供更優質的設施與服務，自104年1月起，共同研究室流式細胞分析暨分選核心服務(Cell Sorter)將推出全新網路預約系統，不分院內外，預約e指通，敬請期待並歡迎多加利用。希望我們所提供的設備對您的研究有所助益，服務品質也令您滿意，為了共研長期的經營運作，請您於發表文章時惠予致謝共同研究室，供為服務成效評鑑之用。

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一、原理簡介

西方墨點法（western blotting）是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用以檢測蛋白質表現量的實驗方法。其利用特定抗體能夠專一結合其抗原蛋白質的原理，對目標樣品進行著色，通過分析成像的位置和訊號深淺，獲得特定的目標蛋白質在擬分析的細胞或組織中表現情況之資訊，為分析檢測特定蛋白質之生物學檢測技術。

圖一、西方墨點法反應

傳統的西方墨點法，是利用底片來接收薄膜上的冷光、螢光或者放射線訊號，再利用顯影液、定影液將底片上的潛像黑化而形成灰階影像。但現今在臨床、生物醫學與生命科學研究領域中，傳統X光底片的使用已日漸式微，以數位光電感應器(CCD)進行影像擷取已經成為新的趨勢。因為以CCD取得影像的方式不但效率遠高於傳統X光片曝光沖洗，在檔案管理、存放、備份以及調閱上更是具有絕對的優勢，同時完全無任何額外的一般或是有毒廢棄物產生。在環保議題日漸受到重視的今日，這更是數位影像系統受到青睞的重要原因。

除了以上優點以外，由於CCD的動態範圍(Dynamic range)，也就是開始感應光線直到過飽和的範圍較大，因此對微弱的光線更為敏感，同時也能夠容納更多的光訊號，意即對光線有著更高的敏感度。此外，因為CCD產生訊號的原理，是將所擷取到的光子轉換為電子後累積為訊號，因此CCD的感光是線性的，這也意味著以CCD感光後取得的影像能夠忠實的反應實際的發光量，因此非常適用於對研究極為重要的定量分析。

圖二、使用數位光電感應器所擷取到的影像進行定量比傳統X光片更為準確

目前發展的螢冷光影像擷取分析系統可取代傳統壓片，用於掃描gel、membrane等薄膜式的sample。藉由優越的大光圈鏡頭以及專利的超低溫Super CCD偵測冷光釋出的光子，可增高靈敏度、降低熱干擾，獲得高畫數的影像品質。配合軟體可將影像數據化，實驗流程約30分鐘，大大縮短傳統呈色或壓片沖片顯影系統所耗費時間。數位式的影像系統可以大量減少底片、顯影液與定影液等耗材的消耗，不但更具經濟效益更環保，也可以避免曝光條件、藥水濃度與底片歸檔等繁複的手動程序。

本系統除以超低亮度冷光擷取影像進行定量分析外，可與相關軟體結合，發展二維電泳 (2D Analysis) 影像分析，微陣列影像分析 (Microarray Analysis) 或菌落分析 (Colony Analysis)。另搭配不同螢光光源模組可拍攝多種螢光，可應用於Fluorescent Western blot 等多重功能。

二、系統應用範圍

●西方墨點分析(Western Blots)	●密度測量法分析
●北方墨點分析	●南方墨點分析(Southern Blots)
●一維電泳分析	●二維電泳分析
●底片影像翻拍測定分析	●菌落計數分析
● Multiplex Dyes 螢光分析	● 2D SYPRO Ruby螢光分析

三、儀器使用說明

目前「螢冷光影像擷取分析系統」於第四、第六、第七及第八共同研究室各有一台，歡迎同仁預約使用。儀器預約或諮詢請洽:第四共同研究室管理人員張瑞宗先生，分機：66680，電子信箱rtchang@ntuh.gov.tw；第六共同研究管理人員王聲耀先生，分機：63177，電子信箱roberts@ntuh.gov.tw；第七共同研究室管理人員袁惠萍小姐，分機：63162，電子信箱hpyuan@ntuh.gov.tw；第八共同研究室管理人員洪煜堃小姐，分機：63480，電子信箱hungyk@ntuh.gov.tw。

表一、醫學研究部各螢冷光影像擷取分析系統比較表
　

共研別第四共研第六共研第七共研第八共研

廠牌/型號
UVP /BioSpectrum 810
GE /LAS4000 GE /LAS4000 UVP/BioSpectrum AC

可檢測模式冷光/螢光/可見光冷光/螢光/可見光冷光/可見光冷光/螢光/可見光

解析度像素 3296 x 2472 um
810萬畫素 3072 x 2048 um
630 萬畫素 3072 x 2048 um
630 萬畫素 2184 x 1472 um
320萬畫素

檢測範圍 17 x 13 cm 21 x 14 cm 21 x 14 cm 21 x 26 cm

曝光時間 0.001s-2h 0.01 s - 30 h 0.01 s - 30 h 0.001s-2h

影像格式
SQV、TIF、JPG、AVI
TIF、GEL TIF、GEL SQV、AVI

分析模式 1D膠片分析模式
菌落計數模式
核酸蛋白質定量分析 1D膠片分析模式
菌落計數模式
陣列分析模式 1D膠片分析模式
菌落計數模式
陣列分析模式 1D膠片分析模式
菌落計數模式

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科學新知

In-Cell Western 快速定量細胞蛋白表現之分析方法

騰達行儀器公司吳美萱經理

In-Cell Western (ICW)分析是為細胞免疫螢光染色定量分析法的一種，相較於傳統西方墨點分析與ELISA分析方法，In-Cell Western分析方法更快速，且具有更高的再現性。

In-Cell Western分析過程直接使用多孔微量反應盤進行免疫螢光分析。待測細胞先培養於微量盤中，經過藥物處理使其特定蛋白的表現變化，細胞經過固定與細胞膜通透化之後，再以專一性一級抗體與近紅外光螢光標示二級抗體偵測標的蛋白，每一well的總螢光訊號可進一步量化分析(圖一)。ICW分析過程不需經過打破細胞並萃取Lysate、SDS-PAGE分離與轉印等繁瑣且多變因的實驗步驟，而是直接觀察完整細胞內蛋白質表現量，結合西方墨點法的專一性與ELISA分析的再現性與高通量。故ICW又稱作Cytoblots、Cell-based ELISA或FACE (Fast Activated Cell-based ELISA)，目前已應用於細胞訊息傳遞路徑研究上、藥物對細胞IC50測定、高通量藥物篩選試驗及研究藥物作用路徑等。

圖一、 In-Cell Western Assay Workflow。

近紅外光(Near Infrared, NIR)螢光波長範圍位於700-800nm (圖二)，相較於一般可見光螢光偵測方式，NIR波長範圍明顯降低來自細胞，反應盤與化學藥物的自體螢光的干擾。In-Cell Western 分析技術與近紅外光螢光偵測技術結合後，使得細胞訊息傳遞研究具有絕佳的靈敏度，可更準確定量分析蛋白質差異表現，且成為更高通量的分析方法。

圖二、 Emission wavelengths of various fluorophores

藉由700與800nm雙頻偵測的雷射光學系統，以及放射波長為700與800nm螢光物質所標示的抗體或染劑，In-Cell Western同時偵測不同的兩種標的蛋白，或使用第二種螢光訊號作為訊號正規化 (Normalization) 基準，校正 well 之間因細胞個數所造成的差異，提升實驗數據的準確性。雙頻偵測與訊號正規化更可防止偽陰性結果，精準評估候選藥物對細胞的作用效果(圖三)。

圖三、 Phosphorylation of ERK in Response to Pathway Stimulation A431 cells were stimulated with serial dilutions of EGF to optimize activation of ERK1/2. (A) Detection of ERK phosphorylation. These images show a portion of a 96-well plate. (B) Quantification of fluorescence. Phospho-ERK signal has been normalized using the total ERK signal from each well, to correct for well-to-well variation in cell number

In-Cell Western分析方法應用範圍包括蛋白質訊息傳遞分析、準確定量蛋白質表現、與先導藥物最適化(lead optimization)過程中對細胞IC50值的測定(圖四)。ICW技術更可做為藥物對單一或多個訊息傳遞途徑影響效應研究的有利工具。其他傳統蛋白質分析方法如西方墨點法，步驟繁瑣且耗費勞力，而高內涵篩選(High Content Screening)方法所需的儀器與耗材費用昂貴，In-Cell Western則提供一個同樣可達到高通量且實惠的分析方法。

圖四、 (A) HeLa cells were treated with increasing amounts of rapamycin in a 384- well format. Dose dependent inhibition of phospho-rpS6-staining yielded an IC50 of 224 pM (n=4). (B) Raw microplate image. Hoffman, GR et al. Assay Drug Dev Tech 8(2):186-99 (2010)

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共同研究室貴重儀器訓練課程　

儀器訓練課程:課程網路報名

	12月18日	凍存技術及程式遞降系統教學
	12月24日	高敏感度生醫冷光影像系統之原理與實機操作講解(GE LAS4000)
	12月25日	流式細胞儀高階軟體分析課程(FlowJo)
	12月31日	螢光顯微鏡暨影像擷取系統之實機示範操作課程(NIKON E400 & TS-100)

研究新知課程:課程網路報名　

104年01月06日　

Application of NGS in clinical cancer research: strategy and example

歡迎您訂閱共同研究室電子報以收取儀器訓練與研究新知課程講習相關資訊。

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