醫學研究部基因定序暨生化核心團隊

博克科技股份有限公司

儀器基本介紹

PhenoCycler系統（舊稱CODEX）為第一台桌上型高內涵組織影像分析系統，拍攝single-cell等級解析度、染色分析樣本多達至少50個蛋白質標的。改版(PhenoCycler^®-Fusion)後可染色分析單一樣本提高達100個蛋白質標的，搭配對焦地圖系統以及組織偵測演算法優化操作流程、縮短拍攝時間。升級款(PhenoCycler^®-Fusion 2.0)除了影像拍攝的速度再次提升之外，新款樣本載台可讓系統一次拍攝2個高內涵的蛋白質組織影像。無論是單一樣本、數十個樣本進行空間研究，還是探索數百個樣本的群級分析，都能滿足空間生物學規模化的研究需求。實機照片如圖1。

圖1  PhenoCycler^®-Fusion 2.0 實機照片

除了可拍攝Ultrahigh-plex 超高內涵組織影像之外，PhenoImager Fusion同時為一獨立的組織切片掃描系統，具專利多光譜 (MSI) 影像技術及獨一無二MOTiF^TM高速全景式分析流程，可拍攝明視野或螢光高達七色及自體螢光全波長拆色分析。每次上機可拍攝最多4個玻片，20分鐘內即可拍完一張七色螢光組織切片。如圖2搭配AI軟體病理分析實現高效率全景式細胞空間分析。

圖2.搭配PhenoCycler拍攝超高內涵組織影像，單獨使用Fusion時可作為螢光或白光組織切片掃片機。

核心技術與原理

超高內涵組織影像：

使用專利編碼配對技術（barcoding-technology）係利用鹼基配對的原理，將barcode與互補barcode分別建構在抗體與螢光上。如圖3。

圖3.Barcode抗體與Barcode螢光接合示意圖

上機前樣本前處理僅需一階段染上所有抗體，第二階段螢光上色、影像拍攝與移除螢光（Reveal-Image-Remove）三步驟為一個循環，皆由儀器自動執行並完成所有循環，減少人力負擔增加研究效率。如圖4。

圖4.PhenoCycler^®-Fusion 運作原理圖

多光譜組織影像：

傳統的螢光顯微鏡系統，為了擷取特定染劑的訊號所使用的濾片多為單一染劑波長區間的窄波長設計。但當需要拍攝超過四種顏色的組織影像時就容易遇到光譜重疊，無法區分染劑訊號的情況。而組織影像常見的背景值與自體螢光更是另外一個需要解決的問題。

為了正確辨識多重染劑訊號並排除自體螢光的干擾，PhenoImager Fusion搭載多光譜濾片以及光譜拆解演算法(Unmixing algorithms)實現真7色(6-plex+DAPI)組織影像拍攝，並利用演算法扣除自體螢光訊號。如圖5。

圖5.人類肺癌細胞組織影像; A-原始影像, B-扣除自體螢光

多重螢光染色：

利用多重螢光組織染色法，可在同一個組織片染最多8個biomarker及DAPI螢光，利用tyramide signal amplification (TSA)技術偵測biomarker並放大訊號10-100倍。如圖6。

圖6.Opal 8-plex螢光影像

與傳統免疫螢光染色不同，允許使用任何標準的未標記初級抗體，包括同一物種的抗體。當螢光分子（tyramide molecule）被二級抗體上的HRP催化，TSA分子會聚集在抗原周圍並形成共價鍵結。如圖7與圖8。

圖7. 一級抗體與二級HRP抗體已結合在抗原，當染劑的TSA分子碰到HRP即發生反應產生自由基。2. 自由基在抗原結合位周圍與酪氨酸行成共價鍵結。3. 反應結束後完成訊號放大。

        
圖8.multiplex IHC 循環染色步驟

優勢為

1. 不受抗體物種限制

2. 訊號放大10-100倍，超高偵測靈敏度

3. 單片組織可染最多8個biomarker

4. 搭配Akoya切片掃描儀器的多光譜影像，迅速去除組織自體螢光

應用領域

腫瘤異質性（Tumor Heterogeneity）與免疫療法（Immunotherapy）、腫瘤微環境 (TME)、空間多體學（Multiomics）、組織細胞鄰域分析（Cellular neighborhood）、發覺稀有細胞族群（Race cell discovery）、神經科學（Neuroscience）、周邊血單核球細胞（PBMC）分析、感染性疾病（Infectious disease）等。

圖9.超高內涵影像拍攝分析頭頸癌組織實例

圖10.超高內涵影像拍攝分析頭頸癌組織實例

頭頸癌組織-103個Biomarkers panel設計涵蓋 immune cell lineage、immune checkpoints、activation states、tissue structure、apoptosis、DNA damage以及metabolism等。此實驗從835823個細胞中辨別出14種細胞型態，並進一步在組織中找到4個異質性的腫瘤區域。這4個腫瘤區域在免疫、增生、上皮等方面的細胞數量與正常組織有相當大的差別，某些腫瘤區域被免疫系統攻擊程度較多而某些較少。結合代謝以及壓力相關的biomarker分佈結果，揭露了腫瘤內部異質性底下不同的臨床反應機制以及抗藥性。如圖9與圖10。

多光譜全景拍攝肺癌組織影像實例(圖11)

　

圖11.用7色染色套組的肺癌組織全景拍攝影像

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