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128Aug.10.2024

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空間蛋白體學技術介紹:光標靶儀Microscoop平台

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主編的話

當生物體之基因序列被大量解序後,生物學研究已進入後基因時代。生物相關學科的下一個主流研究目標將是進一步探究基因序列中各基因所攜帶之蛋白質具何功能?角色?因此,以基因序列訊息資料庫為研究基礎的生物資訊學隨之開始蓬勃發展與應用,包括基因體學(Genomics)及蛋白質體學(Proteomics)。其中蛋白質是真正執行功能的物質,被認為是探討基因體學最終目標,透過蛋白質體學研究可以更加了解基因表現、疾病診斷、及新藥開發等。本刊將介紹兩個空間蛋白質體學新技術,包含本期的「光標靶儀Microscoop平台」與下一期電子報「PhenoCycler Fusion平台」,敬請期待,並竭誠歡迎您訂閱共同研究室電子報收取儀器介紹、研究新知、與每月訓練課程資訊,更歡迎您與我們聯絡,給予我們建議與鼓勵。


研究服務公告

本院共同研究室今年度新購Cytek光譜式流式細胞儀(搭配405 nm488 nm640 nm三支雷射 ),採用新型高靈敏度 APD 半導體多通道全陣列(semiconductor APD- array),可進行全光譜檢測與分析,並同時搭配即時分析軟體之光譜拆解(spectral unmixing)技術,可突破傳統流式細胞儀在螢光組合上的限制,有效區分波長相近但光譜特徵(spectrum signature)不同之螢光分子。共研免疫研究核心將於113828日上午10點半於第七共研舉辦Cytek光譜式流式細胞儀教育訓練,歡迎同仁踴躍報名參加希望我們所提供的訊息對您的研究有所助益,服務品質也令您滿意,為了共研長期的經營運作,請您於發表文章時惠予致謝共同研究室,作為服務成效評鑑之用。
 
                                        
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空間蛋白體學技術介紹:光標靶儀Microscoop平台

醫學研究部基因定序暨生化核心團隊

新析生物科技股份有限公司(Syncell Inc.) 

過往在特定細胞內進行蛋白質組學(proteomics)的研究受限於需要有合適的抗體或探針標定已知蛋白質,才能進行後續的萃取、濃縮、LC-MS/MS分析。此次介紹的光標靶儀Microscoop為結合顯微鏡影像、AI影像辨識與光催化技術(Photochemistry)的平台,可憑顯微鏡下的型態變化挑選有興趣的區域(regions of interests, ROI),以雷射聚焦激發標定目標蛋白質後,再進一步抓取(Pull down)已知與「未知」蛋白質分析,突破抗體與探針不足的限制,具有高靈敏度(Sensitivity)與特異性(Specificity),臨床上已成功找出與三陰性乳癌、阿茲海默症、漸凍人、脂肪肝等疾病相關且前所未知的新蛋白質體,亦可廣泛應用於各種生物醫學研究領域,如癌症、免疫疾病、精神疾病、代謝疾病、及發育生物學等,發掘潛在的疾病病因,提供藥品開發的基石。


(1)

核心技術與原理

光催化技術

本平台使用含有光敏感物的試劑於細胞或組織中,當照射光源聚焦時光敏感物會產生化學反應,常見的如photo-biotinylation,光敏感物催化促使照射區的蛋白質與biotin產生共價鍵鍵結,這樣形同把照射區蛋白質作標記,後續可以裂解組織細胞並使用streptavidin bead抓取並純化蛋白質。(1)

AI深度學習輔助比對拍攝

本平台不需要依賴抗體或特定探針,可針對使用者感興趣的細胞或組織區域(ROI)作光標定,對於型態上看起來不一樣的特異區塊,可利用AI深度學習系統,對雜訊高、背景複雜、介面不清的圖像 (如樹突棘、T細胞-癌症介面等) ,根據每個細胞或組織結構特徵進行0.11秒的精準圖像分割。如圖2所示,Image 為原始影像、Processed為透過AI深度學習系統進而生成的圖像、Merged 為兩者重疊比對,我們可以清楚發現AI所描繪的區域(綠色)不僅完整更是精準的鎖定在使用者感興趣的ROI中。完成圖像處理後,Microscoop將自動以雙光子引導(Two Photon-induced)照明進行photo-biotinylation,可達精準標定至最小0.24 µm的特定區域(ROI),當首次光標定後,AI智能可學習並複製模式,優化拍攝效果,並套用在樣品的其他區域,自動執行大量光標定拍攝,最後透過細胞刮取(Scrape)、採集(Harvest)、裂解(lyes),經由streptavidin抓取(Pull down)循環多次後可提高純化的蛋白質質量,提供後續質譜分析(LC-MS/MS) 或生物途徑分析 (3) 。整體運作模式如圖4所示。

               (2)                                                                (3)


(4)

應用範例:高靈敏度、高特異性應證與新蛋白質發現

為了應證超高量(Ultrahigh-content)空間biotinylation是否可以分離足夠的蛋白質量以滿足質譜分析(MS)的靈敏度,研發單位以應壓體(Stress Granules, 簡稱SGs)的目標光標記(Photolabeling)和抓取(Pull-down)實驗作驗證。採用至少三次生物複製的光標記數值,總共鑑定出 2,785 種蛋白質,取其中1,754 種重複性最高的蛋白種類(5-),經篩選歸納出124種顯著富集的蛋白質組,其中有60%SG相關蛋白(5-);再以PL/CTL比率為基準排序,在前50大蛋白質排名中,除了有74%蛋白質種類已被證實與SGs相關(綠色),亦有從未被揭露(灰色)但確實存在並且與SGs蛋白質有極高的相互作用關係(5-),此驗證結果與採用Microscoop光標定並抓取的蛋白質分析一致(6)

(5-,,)

(6)

為了評估蛋白質組學結果是否足夠特異(Specific)以揭露新的SGs相關蛋白質,進而進行免疫染色(Immunostaining)測試。在測試的13種蛋白質中,有11種與G3BP1共定位,即PDLIM7EIF3CLYWHAERPSAMTA2UGDHDDX17ANLNPSMD3PSMA6MCM2(圖7)。更值得注意的是,PDLIM7DDX17PSMA6在細胞分化中的作用表明壓力管理(Stress management)與細胞發育之間可能存在交互作用,促使SGs的形成。


(7)

總結

Microscoop 藉由AI即時影像辨識與雙光子快速誘導(Two Photon-induced)的蛋白質成分生物素標記,達成高靈敏度與特異性,可針對感興趣區域作光標定,推進了對細胞空間蛋白質組學的研究,為細胞進程(Cellular process)和相互作用的研究發展提供了寶貴的見解。此項技術對於檢測低含量蛋白質和揭露相關蛋白質複合體方面極其重要,從而促使我們對細胞生物學的理解與突破。

相關實驗分析:

Microscoop 應用詳解:

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儀器訓練及研究新知課程

儀器訓練課程報名

0821 蛋白質純化分析儀原理與實機示範(GE AKTA Pure)
0828 Cytek光譜流式細胞儀的介紹與應用

研究新知課程報名

0814 小動物生理遙測技術與肺功能呼吸研究
0821 Incucyte®活細胞影像分析工作站在免疫腫瘤學方面的應用

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