醫學研究部基因定序暨生化核心 吳侑靜助理研究員 

微菌體充斥於我們生活的環境中，在人體，凡是跟環境有接觸的部位就有微菌體的存在。在醫學上，越來越多研究發現微菌體的改變與許多疾病有相當的關聯性，目前主要的研究方向包含感染源的發現與治療，癌症進程的預測、免疫反應的相關性，腸腦的調控、糞便移植等。而微生物體內的DNA序列蘊含著豐富的信息，能夠幫助我們了解微生物的種類、功能以及在生態系統中的作用，因此微菌體定序分析是一項關鍵的研究工具。透過高通量的DNA定序技術，研究人員可以深入挖掘微生物的遺傳資訊，進一步探索它們對環境、人類健康以及生態系統的影響。

微菌體定序分析可依據實驗目的去做設計 (如圖1)，內容包含樣本收集、前處理以及定序策略。為了能得到真實的數據資料，適當的採樣方法、保存條件和DNA/RNA萃取技術都需要於定序前做測試，必須要確保樣本品質具一致性，避免污染和失真。進一步根據研究問題和樣本特性，選擇適合的定序策略(包含定序方法和定序平台)，平衡定序覆蓋度、深度和研究成本。

圖1.

該如何選擇適合的定序方法?

依據研究的目的，定序方法大致上可以分為三種：Marker基因定序主要用於分析細菌、真菌或原核生物的結構與組成，通常是分析16S 或18S 核醣體RNA(rRNA)之基因序列；全基因組定序 (Metagenomics) 或是轉錄體定序 (Metatranscruptomics) 主要用於分析微菌體基因功能上的特徵。表1是這三種定序策略的優缺點及其應用，研究人員可依需求做方法上的選擇。

表1.

方法	優點	缺點	應用
Marker基因定序分析 (如16S rRNA, ITS or18S rRNA)	l快速且便宜的樣品製備和分析 l適合低生物量和高度宿主污染的樣本 l 已經有大量且公開的資料庫可供比對	l PCR 擴增偏差 (bias) l 需要有已知的data set做比對 l 分辨率通常僅限於genus level l 缺乏Functional information l 無法區分是否有活性	用於分析微生物群體的結構和組成，尤其適用於細菌和古菌的鑑定和分類。
全基因組序列定序(WGS）(Metagenomics)	l可直接推斷microbial functional genes的相對含量 l可分辨至species and strains level l可獲得完整微生物群落資訊 l無 PCR擴增相關偏差 l可以發掘novel gene families	l 複雜且昂貴的樣品製備和分析 l 宿主的 DNA 和細胞器的污染 l 無法有效辨識病毒和質粒 l 通常需要較深的測序深度 l 無法區分是否有活性	提供對微生物功能潛力的全面了解，包括基因功能預測、代謝途徑分析等。在臨床上可運用於抗藥性和耐藥性分析。
轉錄體定序(Metatranscruptomics)	l可評估微生物之活性 l捕獲動態的個體內部差異 l RNA virus detection	l 複雜且昂貴的樣品製備和分 l RNA樣本收集與保存 l 宿主的 RNA和細胞器的污染 l 數據偏向於轉錄率高的生物體 l 需要搭配 DNA sequencing觀察活性變化	研究微生物在不同環境條件下的基因表達情況，了解其對環境的適應性和功能。

其中Marker基因定序因為成本較低，最廣為研究人員使用。而擴增區域的選擇主要取決於所涉及的微生物群體組成、研究的目的以及實驗室的技術和資源。以下是一些常用的基因區域：

1.16S rRNA基因：對於細菌和古細菌的分類和多樣性研究，16S rRNA基因是最常用的。此基因普遍存在於原核細胞中，基因長度約1542bp，含量高且拷貝數較多，約占細菌RNA總量的80%以上，由於突變率小。具有足夠的保守性和變異性，序列(如圖2)包含9個可變區（Variable region）和10個保守區（Constant region），保守區序列反映了物種間的親緣關係， 而可變區則能體現物種間的差異。可以用於鑑定和比較微生物的不同群體。表2是常被使用分析的16S rRNA基因區域。

 圖2.

表2

區域	優勢
V1-V3區域	這個片段通常用於研究細菌的多樣性和結構，尤其是在研究複雜的微生物群落時。
V3-V4區域	這是16S PCR中最常用的區域之一，適用於大多數細菌物種，並且通常具有足夠的變異性，可以區分不同的細菌屬和種。
V4-V5區域	變異性程度通常較低的區域，但也常被使用在研究中，由於使用此區域進行與疾病相關的微生物群落研究的參考文獻有很多，使其成為研究與疾病相關的微生物群落結構和組成的理想工具。
V6-V9區域	變異性程度通常較高的區域，特別是在序列的末端。這使得它在進化研究中非常有用，可以用於探索微生物之間的演化關係和親緣關係。

然而，隨著高通量長片段DNA定序技術的出現與發展 (如PacBio和Nanopore)，為了能得到更準確、更全面和更深入的序列資料，全長16S rRNA基因定序開始在微菌體的研究中被使用，相較於短片段特定區域的分析來說，全長的分析對於微菌體的結構分類準確度、基因結構的變異與基因功能預測的準確性有顯著的優勢。

2.18S rRNA基因：對於真菌和原生動物等真核微生物的研究，18S rRNA基因是常用的序列標記。它與16S rRNA在原理上類似，用於分類和鑑定真核微生物。檢體的選擇和採集。

3.ITS區域（Internal Transcribed Spacer）：ITS區域包括ITS1和ITS2，位於真核微生物的rRNA基因間的轉錄間隔區域，由於此區域相對較短，這使得它更容易擴增、序列化和分析。在真菌中，ITS區域被廣泛用於物種鑑定和系統發育研究。

4.23S rRNA基因：與16S rRNA相似，23S rRNA基因用於細菌和古細菌的分類和分析。它通常具有更高的分辨率，特別是在屬(genus)內物種間的區分。此外，23S rRNA基因中的特定區域可能會發生點突變，從而導致微生物對某些抗生素的抗性增加，這些突變可能會經由水平基因轉移的方式在微生物之間傳播。因此如果要做抗生素相關的研究可以選擇此區域做觀察。

5.RNA polymerase基因（rpoB、rpoC等）：這些基因在所有微生物體內都存在，包括細菌、古菌、真菌、病毒等，因此可以應用於廣泛的微生物分析中，不受微生物種類的限制，且基因具有高度變異性，可以用於不同微菌體的分類和鑑定。

該如何選擇適合的定序平台?

定序平台可分為短片段與長片段定序，短片段定序平台(如Illumina)通常具有高通量，能夠同時處理大量的樣品，且定序成本相對較低；長片段定序技術(如PacBio SMRT或Oxford Nanopore) 通常能夠獲得1kb以上甚至於100kb之的長序列，有助於完整地定序基因組、轉錄體或功能基因等，且對於低表達的基因或稀有的微生物種類更具有靈敏度。選擇哪種定序平台需考慮研究目的、預算和實際樣品特性，總括來說，短片段定序通常用於對微菌體群落的結構進行快速、大規模的鑑定，而長片段定序則更適用於對特定物種的基因組或轉錄體進行深入、完整的研究。

醫院及醫學院的研究資源

為協助醫院同仁在微菌體的研究，醫研部基因定序暨生化核心提供了微菌體核酸萃取、16S rRNA 基因v3-v4區域及全長PCR擴增、Nanopore長片段定序等多項服務，可配合醫學院第一共同研究室Illumina Miseq短片段定序分析服務，讓研究人員在微菌體領域的研究更加順暢。

參考文獻：

1. Best practices for analysing microbiomes. Nat Rev Microbiol. 2018, Jul;16(7):410-422

2. Primer, Pipelines, Parameters: Issues in 16S rRNA Gene Sequencing. Methods Protoc. 2023, 6(4), 71

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