新加坡商必帝公司 胡渝翔專員 

流式細胞儀（Flow Cytometry）是一種強大的技術，用於分析和分辨不同細胞亞型和亞群。在臨床研究中，流式細胞儀已被廣泛用於研究許多疾病，如癌症、免疫系統疾病和感染性疾病。然而，為了確保準確和可靠的結果，流式細胞檢測的樣本收案與處理過程需要標準化。本文將介紹一個標準化的流程，用於流式細胞臨床檢體的收案與檢測標準化，以確保高品質和可重複的結果。

流式細胞臨床檢體收案與檢測標準化流程主要包括以下幾個步驟：

1.前期準備

在進行流式細胞檢測之前，需要進行一系列的前期準備工作。這包括確定檢測的目的和項目、選擇適當的抗體和標記、設計正確的Panel和實驗對照組、確定適當的細胞濃度和檢體體積等。這些步驟的標準化，可確保一致的檢測條件和可比性。在樣本收集、處理和獲取的過程中，可能會引入人為瑕疵（artifacts），這些瑕疵可能會對數據造成產生不良影響。因此，檢測和排除這些瑕疵是非常重要的。

2.檢體的選擇和採集。

根據不同的臨床目的，選擇合適的檢體種類，如周邊血、骨髓液、淋巴組織、腹水、胸水等。採集時要注意避免污染和溶血，並使用含有抗凝劑的管子或容器，如EDTA或Heparin採血管。採檢後要即時將檢體送至實驗室，或者按照規定的方法保存和運輸，用來確保檢體的完整性和細胞活性。這些方法一旦確認後應標準化且確實遵守，以確保樣本收集的一致性和可靠性。在檢體採集階段，可能會出現多種瑕疵。例如，在血液樣本收集中，如果未確保適當的樣本與抗凝劑混合，可能會導致細胞破裂或凝聚，進而影響後續的染色和分析。因此，要確保樣本收集的準確性和一致性，需要嚴格遵循標準化的收集程式。

3.檢體處理和前處理

在進行流式細胞檢測之前，檢體需要進行適當的處理和前處理步驟。這包括細胞分離、細胞計數和細胞懸浮液的準備。在處理過程中，需要遵循標準化的操作程式，以確保樣本的一致性和可靠性。

A.檢體染色時機

檢體必須考慮是否應立即收集後且立即染色，或是進行保存直到全部實驗組募集完成再染色。如果可以立即獲得所有樣品，則可以立即染色並立即上機收取結果。但是，在長期研究中，或者如果流式細胞儀離實驗室非常遠，則應考慮染色之前的樣品保存。目的是通過相同的檢體處理染色方式，盡可能將更多的樣本同時間染色處理上機，維持固定的抗體cocktail染色，儀器條件一致等因素降低批次間的變因。每種保存方式將影響樣品組成和抗原表達；因此，好處和缺點將取決於生物學問題，在執行實驗之前應仔細考慮。

B.染色流程

在進行染色之前，需要確保使用高品質的抗體和適當的濃度。染色過程需要嚴格遵循標準化的操作程式，包括溫度、時間和抗體試劑的使用，Cocktail的配置以及離心步驟，還需要進行適當的陰性和陽性對照染色，以確保染色的準確性和可靠性。染色溫度、時間的改變可能造成螢光抗體的染色不足或是tandem dye的不穩定；不同的清洗方式可能造成抗體染色的背景度不同。不同的cocktail製備可能會影響抗體的染色強度或是型態，透過配置一大份的cocktail進行分裝，保存 (需驗證cocktail配置後的穩定度、效期)，或是使用乾粉試劑將盡可能降低這些配製上的差異。此外，離心的步驟改變，也可能導致細胞的回收率變差。

C.抗體批次

不同批次抗體試劑所產生的batch effect，可能是不同批次間抗體染色的背景度不同或是螢光強度的改變。假如抗體夠穩定，為整個實驗一次採購所需的數量。如果是長期的實驗，必須更換批次，為每批抗體試劑進行染色平測以確保抗體有類似/良好的表現。

4.儀器校正和測試

在進行流式細胞檢測之前，需要對流式細胞儀進行校準和測試。這包括檢測儀器的靈敏度、解析度和測量範圍等性能參數。儀器校正和測試的標準化將確保一致的測量結果和可比性。如果不進行流式細胞儀的QC將可能導致抗原解析度降低，或造成不同檢測間有強度的變化。

5.數據收取和分析

適當的調整PMTV確保PMT電壓足夠區分陰性與電子雜訊，使用螢光微珠或是穩定的生物性標準物確認PMTV調整後的目標螢光強度(Target value)是否在儀器校正和測試後仍然維持在相同數值確保數據的一致性。數據收取時應維持相同的流速避免Doublet 與singlet的比例發生改變或是造成訊號的CV增加，若有發生clog則應盡可能排除後再上機收取。確保分析前檔案的螢光補償是正確的，不正常的補償將會導致實驗數據錯誤。

除此之外，盡可能在每次的上機準備reference sample解決技術變異性與實驗中的變異性。技術變異性可以源自實驗和儀器性能的日常差異，無法由使用者控制的儀器變異性（例如，日常儀器校準的差異），此差異能通過normalization來識別和消除。實驗中的變異性（例如，染色過程中的輕微差異）則可透過batch effect correction(批次效應校正)來識別和消除。

上述這些造成數據的差異已有一些可用的套件。例如flowAI與 flowclean 套件，可用於流式細胞儀數據的品管，通過評估三個不同的參數：流速，訊號收取，動態範圍，去檢測和去除異常值。異常值去除後，可使用CytoNorm或是CyCombine套件修正技術變異性與實驗中的變異性這些變異。

結論：

流式細胞臨床檢體收案的標準化流程，對於確保高品質和可重複的結果至關重要。通過標準化的前期準備、檢體收集、檢體前處理和檢體處理、抗體染色、儀器校準和測試、數據收取和分析等步驟，可以確保流式細胞檢測的可靠性和一致性。未來的研究應該繼續努力改進和標準化流式細胞臨床檢體收案的流程，以提高研究的準確性和可靠性。

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