隨著科技的進步，分子生物學的技術突飛猛進，基因體的解序出現突破性的發展，即所謂的次世代定序。相較於以傳統的Sanger定序法(第二期電子報曾介紹)，花了十年由六個國家共同合作，僅解序出人類30億鹼基對的人類基因體計畫，現今若利用次世代定序則可在幾天內完成。例如2011年德國曾爆發致命的出血性腹瀉，之後分離出大腸桿菌的新菌株O104:H4，以NGS技術在幾天內完成其基因定序，並迅速發展出Real-time PCR 快速檢測試劑組，疫情才獲控制。

使用Sanger方法進行基因組定序時，必須先將目標基因一段一段的增幅放大，一段讀長約1000bp，定序完後再進行比對與組裝，操作繁瑣且費時費工費錢；而次世代定序以基因工程的技術將基因組核酸切成小片段，並接上轉接子(adapter)，藉由材料科學與影像系統的協助來進行快速且高通量的定序。不同技術平台之片段讀長略為不同，通常在400bp以下，後續藉由功能強大的資訊軟硬體來進行序列的片段接合，以及基因組的比對與組裝。

自從2005年Roche公司推出首台次世代定序儀Roche/454，各家廠商百花齊放，陸續推出各種不同的平台，如Illumina的Solexa、MiSeq與NextSeq、Life technologies的SOLiD、Ion Torrent與Ion Proton，各以不同的技術與原理來進行次世代定序；亦有各家廠商推出不同的試劑組，可應用於癌症基因篩檢、遺傳性基因檢測、微生物鑑定、法醫鑑定、農產品物種鑑定，與非侵入性胎兒產前診斷等。感謝傅益恩先生與陳囿任博士提供相關資料，以下我們將針對Illumina系統與Ion Torrent的定序原理作介紹。

Illumina系統的定序原理

1. Library preparation－將待測核酸切成小片段，並於兩端接上轉接子。

2. 將已接上轉接子的核酸小片段，注入到表面帶有轉接子互補序列的晶片上，使每一條核酸小片段像是被種在晶片上，接著在晶片flow cell的固態表面進行橋式放大(bridge amplification)，放大一千倍即形成一個叢聚(cluster)。

3. 在flow cell上注入含有4種標記不同螢光且可被移除的去氧核糖核苷酸(dNTP)之反應試劑進行PCR反應，一旦dNTP被接上正在合成的DNA片段，螢光分子就會被釋放，此時以CCD camera擷取叢聚的影像。如此反覆進行螢光標記移除、試劑置換與影像偵測，可快速讀取大量的定序結果。

Illumina系統的定序原理示意圖(請點我開啟連結)

Ion Torrent的定序原理

1. 將待測核酸切成小片段，搭配乳糜化核酸模板擴增技術(emulsion PCR)，先將核酸片段擴增在Ion Sphere Particle上，再將Ion Sphere Particle放入半導體晶片裡進行定序。

2. 定序時分別注入4種dNTP，聚合酶進行接合作用時會釋放出氫離子，產生電位差改變，故可以半導體晶片內的感測元件判讀是A、T、C、G何種鹼基。經過反覆的步驟與偵測，能快速讀取大量定序結果。

Ion Torrent的定序原理示意圖(請點我開啟連結)

數據的分析與判讀

次世代定序除了需要次世代定序儀之外，要獲得好的實驗結果仍有很多問題要面對，如儀器與試劑成本昂貴、實驗數據龐大不易分析等。感謝吳幼麟先生整理了一些解決方案，可供大家參考。

1. 樣品的質與量: 其實在早期的實驗過程中, 研究者已經發現DNA/RNA 的質與量, 對於實驗的成功與否, 佔了絕對的因素。如果DNA/RNA 的量不夠, 或是品質不佳, 則後續的實驗很難得到好的結果。目前已有多家廠商針對NGS樣品核酸純化推出各種試劑，例如從血液、體液、新鮮或冷凍的組織、石蠟包埋的切片組織，甚至可從單一細胞中萃取出品質良好的核酸樣本。

2. 實驗目標設計及實驗操作: 與任何新開發的技術一樣, 在NGS  技術剛推出時, 實驗操作技術難度很高,應用也較受限制。不過在實驗方法不斷的推陳出新下, 這方面已經有長足的進展，甚至已經開始有應用在臨床醫學研究上的商業化試劑面市。

3. 實驗數據分析: 這個問題或許是絕大部份NGS使用者最頭痛的問題。由於NGS 的實驗數據太過龐大，動輒以GB或TB 計算, 絕對無法以傳統的人工判讀進行分析工作。目前市面上已有多家廠商針對癌症基因篩檢研發出套裝分析軟體，經過簡單的設定後, 即可得出比較接近臨床醫師所需要的報告格式。隨著新檢驗套組的開發，相信新的分析套裝軟體也會追上腳步。目前已有免費分析軟體可供使用者進行初步分析。

醫學研究部本著服務研究同仁的初衷，目前正積極評估設立次世代定序研究服務的可行性，歡迎您提供寶貴的建議。

聯絡人：蔡芷季博士 jjtsai@ntuh.gov.tw 分機65759

        劉怡里小姐 aliliu@ntuh.gov.tw 分機65781
　

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