安捷倫科技股份有限公司 廖子萱經理 

　
圖一. Seahorse XF 海馬生物能量分析儀

許多的癌症研究中已發現，實體瘤是一個低氧、營養物質缺乏、酸性且具有免疫抑制的微環境。由於腫瘤細胞不正常地快速增殖，大量消耗環境中的氧氣以及能量代謝所需的來源如葡萄糖、麩醯胺酸等營養物質。另一方面，癌症組織附近的血管內皮細胞由於暴露在致癌因子下，造成血管功能逐漸失常，無法正常輸送氧氣，而癌細胞快速增殖的特性，也導致腫瘤組織與血管組織間的距離越來越遠，使氧氣難以擴散到腫瘤組織。種種因素綜合起來，最終發展成長期低氧的腫瘤微環境。^[1]而浸潤於腫瘤組織的免疫細胞則因為無法與癌細胞競爭氧氣與營養物質，以及酸性環境與免疫抑制分子等因素使免疫細胞對腫瘤的抗原逐漸不敏感，最終造成免疫細胞殺傷功能漸漸失常、耗竭，腫瘤加劇惡化。[2]因此，對於癌症與免疫研究領域，通過Seahorse XF技術進行低氧研究，模擬真實生物體內環境，能幫助研究人員探討免疫細胞殺傷腫瘤的能量代謝表現。

Seahorse XF海馬生物能量分析儀可以放置於低氧工作站(hypoxia chamber)中，並搭配低氧專用的檢測與分析模式進行能量代謝的分析，幫助研究人員精準分析細胞在低氧下的氧化磷酸化作用與糖解作用。在低氧下，會誘導轉錄因子HIF-1α(Hypoxia-inducible factor 1-alpha)的穩定表達，HIF-1α會促進GLUT的表達並增加葡萄糖的吸收之外，還會上調控 PKM、PGK1、PGAM1與LDH等酶增加糖解作用的表現，並刺激PDK1抑制PDH，使丙酮酸無法轉換成乙醯輔酶A，乙醯輔酶A無法進入到有氧呼吸的TCA循環中，粒線體的氧化磷酸化作用因此被抑制。

當細胞培養在低氧的環境中，可以觀察到如圖二所示的能量代謝轉換(Metabolic Shift)的現象，這個現象稱之為「Crabtree效應」。細胞為了適應低氧，會增加糖解作用來產生足夠的ATP供能。[3]以下這是一個MCF-7乳癌細胞的在低氧下的糖解壓力實驗ECAR動力學曲線圖[4]：

圖二、Seahorse XF 糖解壓力實驗：依序加入葡萄糖、Oligomycin以及2-DG，檢測細胞的糖解能力與糖解儲備值等參數。

將MCF-7乳癌細胞分別培養在5%的氧氣濃度與正常氧濃度的環境下，各培養了24個小時，接著，分別進行糖解壓力實驗與粒線體壓力實驗。首先，在糖解壓力實驗中，當MCF-7細胞在5%的氧氣濃度下，第一個化合物－葡萄糖打入細胞孔之後，ECAR顯著上升，比正常氧濃度的組別要來的高，代表糖解作用在低氧的影響下有升高的表現。

圖三、Seahorse XF 粒線體壓力實驗：依序加入Oligomycin、FCCP、Antimycin-A/Rotenone，檢測粒線體的基礎呼吸值、最大呼吸值與呼吸儲備值等參數。

在圖三的粒線體壓力實驗中，我們發現5%氧氣濃度下的MCF-7細胞的氧氣消耗速率(Oxygen Consumption Rate，OCR)整體較低，代表粒線體的氧化磷酸化作用被抑制之外，還可觀察到包含加藥前的基礎呼吸值、打入第三個化合物解偶聯劑FCCP加入後的最大呼吸值以及呼吸儲備值(呼吸儲備值等於最大呼吸值扣除基礎呼吸值)等都有下降的表現；此外，第二個化合物Oligomycin打入後，低氧組別的OCR值也較低，Oligomycin為ATP合成酶抑制劑，此現象代表通過粒線體產生的ATP產率也有下降的情形。

       圖四、MCF-7細胞的能量代謝圖。

通過圖四的OCR vs ECAR能量分析圖，根據兩個組別分布的位置，可以觀察到正常氧濃度的MCF-7細胞分布在圖的左上方，表示其偏向使用粒線體的氧化磷酸化進行能量代謝；相反地，在低氧5%濃度的MCF-7細胞則分布在圖的右下，偏好使用糖解作用來產生ATP，這種因為低氧的環境因素導致能量代謝轉變的現象就是所謂的Crabtree effect。

圖五、MCF-7、MCF-10A與C2C12細胞的能量代謝圖。

若跟正常健康的細胞比較，如MCF-10A乳腺上皮細胞(藍色)與C2C12肌母細胞(綠色)，於圖五的OCR vs ECAR能量分析圖上，可以發現MCF-10A和C2C12細胞於正常氧濃度(實心)和低氧濃度(空心)的能量代謝方式並無顯著變化，但MCF-7乳癌細胞(黑色)在不同的氧氣濃度下，能量代謝方式有相當程度的不同。

圖六、Seahorse XF 糖解壓力實驗：MCF-7細胞OCR隨時間變化的動力學曲線圖。

Seahorse XF分析技術會實時同步偵測OCR與ECAR兩種數值，因此我們可同步取得粒線體氧化磷酸化與糖解作用的數據。在圖六的糖解壓力實驗中，我們改觀察OCR的變化，則可發現低氧的MCF-7細胞在注入葡萄糖後，與正常氧的組別相比，OCR顯著下降，若和圖二的ECAR vs Time 動力學曲線圖結果比較，低氧組別的ECAR值有顯著上升的情形，代表葡萄糖的加入使糖解途徑有更多受質來源可產生ATP，能量代謝方式改變成以糖解為主，氧化磷酸化表現下降。

圖七、以氯化鈷化學法模擬細胞於低氧狀態的能量代謝表現。

除了利用低氧工作站搭配Seahorse XF Technology進行低氧研究，也可以使用氯化鈷模擬低氧情形，氯化鈷會促使HIF-1α穩定表達不降解，因此常被做為模擬低氧條件的方法之一。將100 µM 氯化鈷加入到MCF-7細胞後培養16個小時，接著進行海馬實驗。圖七可以觀察到注入葡萄糖後，加入氯化鈷組別的ECAR值有上升的情形，這個現象跟圖二的結果，也就是於低氧工作站以5%低氧濃度培養的MCF-7細胞有類似的表現，證實只在低氧才會穩定表達的HIF-1α會對糖解作用表現有增加的影響。

將培養的細胞系或原代細胞置於低氧環境中，更能接近生物體in vivo的狀態，有助於改善in vitro的實驗模型，幫助了解不同疾病的病理機制在低氧下的動態能量代謝表現，目前Seahorse有完整並已優化、驗證過的生物能量於低氧研究的標準實驗流程[5]，能幫助您更輕鬆地進行實驗與數據分析。除了免疫、癌症領域與低氧有緊密關聯之外，許多疾病的發展包含心血管疾病、肥胖與代謝性疾病、腎臟疾病等都跟低氧環境有所關聯。通過Seahorse XF技術，在不須標記細胞的情形下，同步實時檢測OCR和ECAR，觀察活細胞動態的能量代謝作用，幫助研究者通過基因工程或藥物等各種方式，調控細胞的能量代謝途徑，恢復粒線體的功能，並可作為未來疾病治療的新方向。

參考文獻：

1. Chen, Z., Han, F., Du, Y. et al. Hypoxic microenvironment in cancer: molecular mechanisms and therapeutic interventions. Sig Transduct Target Ther 8, 70 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01332-8

2. Buck MD, Sowell RT, Kaech SM, Pearce EL. Metabolic Instruction of Immunity. Cell. 2017 May 4;169(4):570-586. doi: 10.1016/j.cell.2017.04.004. PMID: 28475890; PMCID: PMC5648021.

3. Diaz-Ruiz R, Rigoulet M, Devin A. The Warburg and Crabtree effects: On the origin of cancer cell energy metabolism and of yeast glucose repression. Biochimica et Biophysica Acta. 2011 Jun;1807(6):568-576. DOI: 10.1016/j.bbabio.2010.08.010. PMID: 20804724.

4. Identifying Metabolic Phenotype Switches in Cancer Cells Using the Agilent Seahorse XF Analyzer in an Hypoxic Environment, Application Note, publication number 5991-7146 EN, https://www.agilent.com/cs/library/applications/5991-7146EN.pdf

5. Conducting an XF Assay in a Hypoxia Chamber, Agilent Protocol, publication number 5991-7267EN, http://www.agilent.com/cs/library/technicaloverviews/public/XF-AssayHypoxia-Chamber.pdf

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