Agilent Technologies Taiwan Ltd. 詹舜安 資深液相層析質譜應用專家 

在生物醫學研究領域中，代謝體學技術一直與基因體學、轉錄體學、蛋白體學等常用技術結合來全面性地研究生物的生理調控、酵素活性及細胞代謝過程。從代謝體學的數據可以得知代謝物在實驗組別間的濃度變化，但濃度的增加可能源自合成代謝途徑的活化，也可能是因為消耗途徑的抑制，反之亦然。因此，為了能夠更深入的了解代謝物在細胞或生物體內的動態變化，代謝流 (Metabolic Flux) 就成為一個重要的研究工具。代謝流是從傳統代謝體學基礎上發展的一項新技術，透過給予同位素標定的代謝物於細胞/生物體中，結合NMR、GC/MS或LC/MS儀器分析，追蹤代謝物同位素的動態轉化過程。¹第十共研代謝體暨藥物分析核心實驗室最新添購的液相層析高解析質譜儀平台(6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF)，可發展代謝流技術並應用在疾病機轉探索、新藥開發與各類生醫領域之研究，未來也規劃開發相關平台。本期電子報將介紹代謝流技術與應用案例。

技術介紹:

代謝流，即生物體處於一定環境條件下，參與代謝的化合物在代謝途徑中按照一定規率流動所形成的轉化過程。技術上可利用¹³C或¹⁵N穩定同位素追蹤法追蹤代謝物參與了哪條功能性代謝途徑，目前常用的同位素如¹³C同位素的葡萄糖 (¹³C-Glucose)、¹³C同位素的麩醯胺酸 (¹³C-Glutamine)或¹⁵N同位素的麩醯胺酸 (¹⁵N-Glutamine)等，當給予不同的同位素後，經過代謝流分析可追蹤代謝途徑的流向和規律。^2-4圖一範例中採用不同的同位素標定代謝物來源可以進行不同代謝途徑的代謝流研究，如¹³C-葡萄糖可對醣解途徑進行同位素追蹤，了解葡萄糖結構上6個¹³C的碳源轉化過程。2022年的一篇文獻回顧中也提到了代謝流體學 (Fluxomics)的蓬勃發展，統計目前約70%的代謝流技術被應用在三羧酸循環 (TCA Cycle)、醣解途徑 (Glycolysis Pathway) 和戊糖磷酸途徑 (Pentose Phosphate Pathway, PPP) 三種最重要的生物代謝途徑研究。⁵

圖一、不同的同位素標定代謝物來源應用在不同代謝途徑的代謝流研究(實心:¹³C,空心:¹²C)⁴

　

1. 技術工作流程:(圖二)

• 建立目標(功能性)代謝物列表

• 液相層析高解析質譜(LC/Q-TOF)數據採集

• 代謝流同位素追蹤解析、提取

• 代謝物計算結果與圖表分析

所有分析流程在不同目標代謝物標準方法建立後, 由四步驟軟體流程化運行完成分析。

圖二、代謝流質譜分析工作流程

2. 代謝流質譜數據結果分析:

以圖三為例，採用¹³C同位素的麩醯胺酸 (¹³C-Glutamine)，利用上述代謝流技術可完成三羧酸循環 (TCA Cycle) 上代謝物的同位素異數體 (Isotopologues)分析。如圖三所示，2-羥基戊二酸(2-Hydroxyglutarate)有6種同位素異數體，質譜數據可解析在不同時間點(0、0.5、1、3和8小時)追蹤到不同的同位素異數體變化。而代謝流研究中，生物體給予¹³C同位素的麩醯胺酸可追蹤同位素進入三羧酸循環後的各種代謝物結果；並顯示在不同時間點時，各種代謝物產生不同的同位素異數體變化，然後進一步分析代謝的流動方向性和轉化順序性，能更深入的闡釋生物學的現象或釐清相關機轉問題。

圖三、代謝流質譜數據結果分析範例

應用範例:

2018年，全美著名癌症研究中心 MD Anderson，利用液相層析高解析質譜進行代謝流分析，針對急性骨髓白血病 (Acute Myeloid Leukemia, AML)的醣解途徑進行研究。從過去大量研究中表明，癌細胞常表現旺盛的醣解作用來產生能量。除了依賴醣解途徑外，也需要氧化磷酸化 (OXPHOS) 提供生物能量來源。文獻六研究使用IACS-010759, 是一種具潛能和選擇性的粒線體電子傳遞鍊複合I抑制劑。從代謝體學數據說明當IACS-010759抑制劑作用後，所有胺基酸中只有天門冬胺酸 (Aspartate)的含量明顯下降，並且觀察到三磷酸核苷酸也同步下降，推論氧化磷酸化能量合成過程受到抑制 (圖四)；研究團隊進一步設計代謝流實驗，在抑制劑作用下的癌細胞在給予¹³C天門冬胺酸 (¹³C -Aspartate)的同步作用後，嘧啶核苷酸合成途徑 (Pyrimidine Nucleotide Biosynthesis) 中[M+3]同位素異數體的含量明顯升高，顯示補充天門冬胺酸能恢復嘧啶核苷酸合成作用。⁶

圖四、 IACS-010759抑制劑在氧化磷酸化抑制作用的代謝體與代謝流研究結果⁶

References：

1. Giera, M.; Yanes, O.; Siuzdak, G., Perspective Metabolite discovery: Biochemistry's scientific driver. Cell Metab 2022, 34 (1), 21-34.

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