三典科技有限公司 黃韋強專員 

ECIS介紹

ECIS是一種定量、無須標記、非侵入性、可在線即時分析細胞行為的實驗方法，ECIS 的基本原理由諾貝爾物理學獎得主Ivar Giaever教授和同事Charles R. Keese教授於 1984 年首次報告。簡單來說，細胞培養盤內有微小金屬電極，儀器給予微弱、不影響細胞的交流電並記錄阻抗。電極上的細胞作為絕緣體，會影響此阻抗值，因此可以判斷細胞行為。如圖1所示，ECIS系統包含主機、安裝有ECIS軟體的電腦、晶片架(array holder, array station)、培養盤。連接主機及晶片架的扁平帶狀纜線使晶片架及架上的培養盤可以放置於培養箱內，相較於其他endpoint實驗方法，ECIS系統可以得到即時的、動態的、完整連續的數據。並且因為金屬電極很薄，若有需要可在 ECIS實驗期間進行明視野和相位差顯微鏡觀查或影像擷取。

圖1: ECIS Zθ系統

阻抗的表現會受到以下因素影響: 1. 附著在電極的細胞的數量(amount of the cells)，2. 附著在電極的細胞的形態(morphology of the cells)，3. 細胞附著在電極的附著性質(nature of cell attachment)。接下來簡單說明一些藉由阻抗觀察細胞行為的例子。

圖 2

細胞貼附及增殖於電極上，使阻抗升高；細胞匯合(confluence)時，阻抗值來到高原期(圖2)。除了圖中舉例以不同的細胞作為變因，我們也可以以環境作為變因，造成同一種細胞貼附或增殖的表現不同。例如更改medium配方、添加藥物，或是以不同的蛋白質或方法預處理ECIS培養盤底部。

圖 3

給予細胞任何刺激，例如造成細胞損傷後觀察其再生. 細胞受損使阻抗值下降，其後細胞復原使阻抗值回升(圖3)。此概念可以應用於細胞毒性(cytotoxicity)測試，或是反向測試減緩毒性的藥物處理。須注意的是，依照給予的刺激不同，阻抗值也有可能是不變或是上升。例如誘導幹細胞分化為排列更緻密的細胞(例如骨細胞osteocyte)，阻抗則會上升。

圖 4

電燒電極上的細胞或是在種細胞時先開啟電極上的電柵(本機有此二功能)，再觀察周圍已達細胞匯合(confluence)的單層細胞(monolayer)遷徙至電極. 這兩種方法可以取代傳統人為操作的scratch assay。Scratch assay會有誤差大、操作及分析繁瑣、與僅得到endpoint數據的不客觀及不方便性。圖4所展示為電柵方法，當細胞匯合(confluence)後，關閉電柵，若細胞遷徙至空電極，則阻抗值會上升。雖然 ECIS 背後的物理理論看似很複雜，但實驗操作、數據採集和分析卻很簡單. 因此ECIS實際應用於越來越多不同的研究領域中(表1)。尤其目前第八共同研究室有96晶片架(96 station)搭配ECIS Zθ主機，方便同仁篩選藥物或進行其他高通量的實驗。接下來分享幾篇以ECIS進行屏障功能(barrier function)及癌症相關的研究文獻。

表1: 列舉ECIS應用

Apoptosis	Attachment and spreading	Barrier function
Biofilms	COVID-19	Cell morphology
Cell-cell interactions	Cells under flow	Chemotaxis
Contractility	Cytotoxicity	Differentiation
Electroporation	Proliferation	Inflammation
Invasion	Micromotion	Migration
Signaling transduction	Virology	Co-culture
……	……	……

欲瞭解更多應用詳情，請至Applied Biophysics官網。

以ECIS評估潛在藥物

論文1:Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) as a Convenient Tool to Assess the Potential of Low Molecular Fraction Derived from Medicinal Fungus Cerrena unicolor in Action on L929 and CT-26 Cell Lines

本篇研究使用ECIS監測從藥用真菌 — 單色齒毛菌(Cerrena unicolor)中分離出的低分子分離萃取物(ex-LMS)的藥物動力學(pharmacokinetics)。對小鼠L929纖維細胞和結腸癌CT26 單層細胞，用不同濃度的 ex-LMS進行處理。如圖5所示，ex-LMS對L929纖維細胞的生理活動沒有顯著影響；同時，ECIS顯示ex-LMS使結腸癌細胞CT26存活下降。說明可以進一步研究ex-LMS於抗癌治療或化學預防的功用，其對正常細胞沒有明顯的有害影響。

圖5: 使用濃度為 C1 (2.285 µg/mL)、C2 (22.85 µg/mL)、C3 (228.5 µg/mL) 的 ex-LMS處理L929或CT26的80小時期間，ECIS所量測到的阻抗變化。

論文2:Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells

分別用不同濃度的洋地黃毒苷(DTX，一種強心苷)和其人造類似物D6MA處理非小細胞肺癌細胞(NCI-H460)、非致瘤性人肺上皮細胞(BEAS-2B)，以EICS進行實時檢測以評估細胞增殖(proliferation)、粘附(adherence)、型態(morphology)。如圖6所示，實驗表明，兩種化合物皆有導致最終不同細胞行為及命運的閾值濃度。

圖6: 非小細胞肺癌細胞(NCI-H460)在暴露於不同濃度DTX (圖6a)和D6MA (圖6b)的實時行為變化；非致瘤性人肺上皮細胞(BEAS-2B)在暴露於不同濃度DTX (圖6c)和D6MA (圖6d)的實時行為變化。

以ECIS評估潛在藥物的一項重要優勢是，我們可以獲得藥物處理期間內的連續數據，若有bi-phase/multi-phase現象，則可被觀察到，而這是end-point方法經常遺漏的部分。

以ECIS研究細胞屏障功能(barrier function)

論文3:Endothelial Barrier Disruption by Lipid Emulsions Containing a High Amount of N3 Fatty Acids (Omegaven) but Not N6 Fatty Acids (Intralipid)

研究大量ω3脂肪酸(Omegaven)乳化劑與大量ω6脂肪酸(Intralipid)乳化劑對內皮屏障功能的影響。在細胞接種、生長期和生長平台期期間添加三種濃度（1 、0.1、0.01 mM）的Omegaven或Intralipid。如圖7所示，本研究的發現與之前的研究相矛盾，揭示了高濃度的 Omegaven（而非Intralipid）會損害內皮細胞的屏障功能。

圖7: 以電阻觀察細胞屏障功能

透過ECIS Zθ，細胞屏障的變化可以通過測量不同頻率下的電阻值輕鬆量化，其原理類似於跨上皮/內皮電阻 (transepithelial/endothelial electrical resistance, TEER) 檢測。電阻由兩部分影響，即細胞-細胞和細胞-基底的互動。不同於TEER，ECIS Zθ系統通過複雜的運算，可以區分這兩個部分。ECIS已經被使用於證明一些藥物、細胞因子、免疫細胞或是病毒會破壞上皮細胞或內皮細胞的屏障功能。

關於ECIS Zθ系統的運算模型，詳情請見Applied Biophysics官網，或是蒞臨醫學研究部，我們有美國原廠專員和台灣代理商教學的錄音和錄影提供使用者參考，研究人員還可提供研究諮詢。歡迎指教!

本期所用的論文如下：

• Iwakura, T., Marschner, J. A., Zhao, Z. B., Świderska, M. K., & Anders, H. J. (2021). Electric cell-substrate impedance sensing in kidney research. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association, 36(2), 216–223. https://doi.org/10.1093/ndt/gfz191

• Prendecka-Wróbel, M., Pigoń-Zając, D., Jaszek, M., Matuszewska, A., Stefaniuk, D., Opielak, G., Piotrowska, K., Rahnama-Hezavah, M., & Małecka-Massalska, T. (2022). Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) as a Convenient Tool to Assess the Potential of Low Molecular Fraction Derived from Medicinal Fungus Cerrena unicolor in Action on L929 and CT-26 Cell Lines. Molecules (Basel, Switzerland), 27(19), 6251. https://doi.org/10.3390/molecules27196251

• Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C., Gupta, N., Rojanasakul, Y., O'Doherty, G., Stueckle, T. A., & Dinu, C. Z. (2020). Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et biophysica acta. General subjects, 1864(11), 129683. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2020.129683

• Gueguen, E., Morsy, Y., Scharl, M., Krämer, S. D., Zaugg, M., Hersberger, M., Rogler, G., & Wawrzyniak, M. (2022). Endothelial Barrier Disruption by Lipid Emulsions Containing a High Amount of N3 Fatty Acids (Omegaven) but Not N6 Fatty Acids (Intralipid). Cells, 11(14), 2202. https://doi.org/10.3390/cells11142202

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