禾豐醫企業有限公司林宗成經理 

什麼是自體螢光(Autofluorescence, AF)

如字面上的意思，即為細胞自身所帶有的螢光訊號，也被稱為背景值(Background)、雜訊(Noise)或是基礎值(Baseline)，可以簡單理解成不想被判斷成真正訊號的螢光訊號，而這些不受喜愛的訊號又是怎麼來的呢? 當雷射光照射到細胞時，細胞內的結構成分(Structural components)和代謝物(Metabolites)受到雷射光激發而散射出的螢光訊號，像是Collagen、Elastin或是Cyclic ring compounds (e.g. flavins & NADPH)、Aromatic amino acids (e.g. tyrosine & tryptophan)以及細胞內的胞器Lysosomes、 Mitochondria都可能因為雷射光激發而散射出自體螢光，因此待測細胞染上螢光抗體後，在流式細胞儀偵測的過程中，除了抗體上帶有的螢光分子會被激發出訊號外，細胞本身的自體螢光也同時會被雷射所激發產生。

自體螢光造成什麼問題

自體螢光的強弱對於後續實驗的分析有著不同程度的影響，當自體螢光偏弱時，對於後續分析真正螢光訊號並無太大影響，即使與真正訊號的螢光波段相近時，也不會出現分辨率(Resolution)變差的問題；相反的，當自體螢光的訊號很高時，除了可能發生溢光(Spillover)問題導致相似波長的訊號受到干擾外，同時也會出現訊號分辨率變差的狀況。

已知造成自體螢光強弱的差異有許多影響因子，例如:細胞的代謝狀態、細胞生長/增殖、營養供應、能源生產高低等生理狀態，或是人為操控的實驗條件，如:染色方案(例如:是否使用福馬林固定(Fixation)或細胞膜打洞(permeabilization))、藥物刺激的有無..等等都是自體螢光產生或改變的可能因素。

全光譜分析系統的優勢

過去若在傳統濾片式的流式細胞儀上偵測到自體螢光時，基本上只能夠透過螢光補償(compensation)的方式將自體螢光訊號扣除，但常常會出現自體螢光的訊號會被欲分析的螢光偵測器一併接收讀取，所以導致訊號無法使用螢光補償的方式進行修正，導致訊號的解析度大大下降，甚至真正的螢光訊號被自體螢光所遮蓋(compromise)。

然而在CYTEK的全光譜分析系統Full Spectrum Profiling™ (FSP™)的處理之下，自體螢光的訊號不再是被單一偵測器所接收辨認，而是透過專利設計之特殊解波器 (CWDM)技術將散射光束進行拆分，把每個波段的散射光訊號都全部接收，最終將自體螢光的訊號光譜從Unstained樣本中完整讀取出來，建立一個特殊的光譜署名(Spectral Signature)，並透過即時光譜拆解(spectral unmixing)技術，將自體螢光的訊號從樣本的混合型光譜中給拆解出來並進行去除，除了提升實驗數據的解析度，也大大降低處理自體螢光訊號的複雜流程。

SpectroFlo可以如何幫助使用者去除自體螢光的干擾

當分析過程中需要將自體螢光去除時，可以就樣本特性簡單分為二大類屬性，並依照屬性來執行不同自體螢光的去除策略。

第一類屬於Homogeneous Samples(例如: cell line或來自同樣來源的細胞像是lymphocyte)，這些都是屬於自體螢光相似的細胞，因此在進行自體螢光去除時，只要在軟體上執行光譜拆解(spectral unmixing)時，於軟體介面上勾選 “Autofluorescence as a Fluorescent Tag”的選項(圖一)，軟體將會以Unstained樣本的光譜署名當成其中一個特殊的光譜來針對樣本進行光譜拆解，並於最後分析時，讓使用者看到扣除自體螢光的樣本後所呈現出來的結果。

圖一、於SpectroFlo software上執行Autofluorescence Extraction的步驟。於執行Unmixing的過程中，點選“Autofluorescence as a Fluorescent Tag”即可將自體螢光進行去除，從左圖中可以看到原本iPS經過轉染eGFP後，因為細胞自體螢光很高，導致eGFP+的細胞與未轉染的細胞無法有效的區分開來，但經過自體螢光去除後，可以看到右圖的結果中，其訊號的resolution有顯著的被提升。

第二類屬於Heterogeneous samples，而其中又可再細分成具有相似光譜(similar spectrum) 或者不同光譜(different spectrum)兩種，具有相似光譜的例子像是Whole Blood, PBMCs)，在此種樣本中可能同時存在不同種類的免疫細胞，但是這些免疫細胞的光譜樣態(Lymphocytes and Monocytes)基本差異無幾，只有在亮度上有所區別，於此情況下，可以自由選擇其中一種細胞來當成unstained樣本當成提供signature的細胞來源進行自體螢光的去除。(圖二)

圖二、選擇類似光譜署名的細胞進行Unmixing的比較結果。從上圖中可以看到Lymphocytes 與 Monocytes雖然為兩種不同的細胞族群，但是光譜樣態相當類似，唯一差別在於螢光強度，在此狀態下，選擇使用Lymphocytes 或 Monocytes自身的光譜署名來進行Unmixing時，對於分析結果並無太大的差異。

若當樣本被歸類於具有不同光譜的種類時，像是Bone marrow或是Tissue infiltrated lymphocytes 要進行自體螢光去除時，單純只用Unstained所提供的平均光譜署名，可能無法將其他具有特殊自體螢光光譜署名所產生的自體螢光進行去除，並導致Unmixing error；這時候軟體可以利用Define additional AF signatures的方式將組織中不同細胞的自體螢光都逐一建立成特有的spectral signature，並在執行光譜拆解(spectral unmixing)時，將這些特有的spectral signature當成Reference Control的一種，最後將這些不同種類的自體螢光都從分析樣本中逐一拆解。最終將導致Unmixing error產生的自體螢光都去除，得到沒有自體螢光影響的樣本進行分析。(圖三)

圖三、Define additional AF signatures將多種AF訊號進行去除。從Unstained 的樣本中找出具有不同的光譜署名的細胞族群，並將此細胞族群Export出來建立成特有的spectral signature，並將這些signature當成Reference Control的一種，於Unmixing時，一併與之拆解，達到去除多種自體螢光的目的。

此外，若實驗過程中，有需要使用同一套Reference Control進行光譜拆解，但樣本的自體螢光差異很大時，例如來自各個不同臟器的免疫細胞要同時分析，我們也可以善用軟體在設定實驗模板時，選擇 “Group Specific Unstained ”的功能來提升實驗效率，不需要依每種不同自體螢光的樣本而創立許多獨立的實驗檔案，只需要在每個實驗組中，額外添增一個Group Specific Unstained，軟體在進行Unmixing時即會自動選取正確的自體螢光進行扣除與拆解。(圖四)

圖四、建立Group Specific Unstained的方法。在實驗設定中，於建立Tube list的選單上，於實驗group上額外添增一個Group Specific Unstained，軟體在進行Unmixing時即會自動選取正確的自體螢光進行扣除與拆解。

總結

隨著光譜流式細胞儀能夠偵測的螢光數目越來越多，使用者能夠同時分析的樣本複雜度也隨之增高，也順應現今的研究趨勢，研究廣度由原本的單一族群細胞漸漸的發展至細胞彼此間的交互作用，甚至是整個微環境的複雜交流，因此樣本複雜度的增高自然也導致自體螢光的干擾隨之增加。過去傳統濾片式的流式細胞儀所無法處理的自體螢光，也隨著全光譜分析的偵測特性有了很好的解決手段，透過將不同的自體螢光之光譜署名逐一提取，並將之當成一種特殊的螢光光譜，並透過光譜拆解將之去除，讓研究者能夠更容易取得不含自體螢光的樣本進行真正的訊號分析，提升研究的可信度與效率，期待未來能夠幫助研究者發現以往所無法看到的研究細節與成果。

醫學研究部流式細胞核心於2022年增設一台Cytek Aurora光譜式流式細胞儀，歡迎有需求的研究人員前來預約使用，預約相關事宜請洽流式細胞核心技術人員，分機265726。

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