醫學研究部共同研究室

本期介紹的ELISA reader 系統是藉由抗原與抗體反應後，加入不同染劑進行定量分析的方式，可利用可見光、螢光及冷光等光源偵測﹔動力分析儀的原理與ELISA reader相似，可用來偵測內毒素，發展新式定量檢測法。此外，我們也請細胞治療中心籌備顧問吳怡萍博士針對近期國內外細胞治療產業做一個概括性介紹。下一期電子報將介紹次世代基因定序，有興趣的同仁請密切注意下期的電子報喔！歡迎您訂閱共同研究室電子報以獲得相關訊息。同仁對於共同研究室如有其他新的研究服務需求，更歡迎您與我們聯絡，給我們建議與鼓勵。

為協助醫學校區學術研究，醫學研究部在2014年已設置了配備有三支雷射的cell sorter，並聘任專職技術師楊凱婷小姐 (ntuhsorter@ntuh.gov.tw)負責相關業務，現正實施優惠活動：期間使用三個時段贈送一個時段，還有機會獲得神秘小禮物。正熱切開放服務中，歡迎大家多加利用(預約規則請參閱醫研部網站)。

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ELISA的發展

西元1971年，Engvall和Perlmann發表了酵素連結免疫吸附劑分析方法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）用於IgG定量測定的文章，使得1966年開始用於抗原定位的酵素標定抗體技術，發展成液態樣本中微量物質的測定方法。其基本原理是：(1)讓抗原或抗體結合到某種固態載體表面，並保持其免疫活性。(2)讓抗原或抗體與某種酵素連接成酵素標定之抗原或抗體，這種酵素標定抗原或抗體既保留免疫活性，又能保留酵素的活性。

ELISA原理

在測定時，把待測樣本（測定其中的抗體或抗原）和酵素標定抗原或抗體依序與固態載體表面的抗原或抗體結合反應，以緩衝液洗去未結合的物質，最後結合在固態載體上的酵素量與樣本中待測物質的量成一定的比例，然後加入酵素反應的受質，經酵素催化變成有色產物，產物的量與樣本中待測物質的量有直接關係，所以可根據顏色反應的深淺來做定性或定量分析。

ELISA方法

吸收光：A. 核酸或蛋白質定量。B. 免疫檢測。C. 藥物溶解分析。D. 細胞檢測(MTT等)。E. 蛋白分析(Bradford, BCA, Lowry等)。F. 內毒素(Limulus Amebocyte Lysate, LAL)分析。G.藥物分析。H. 酵素動力學分析。I. 細菌辨識。
雙位點法：針對抗原分子上的兩個不同抗原決定位的單株抗體分別作為固態抗體和酵素標定抗體，在測定時可同時加入，兩個步驟合併成一步，大幅縮短反應測定時間。
間接法：為檢測抗體最常用的方法，其原理是利用酵素標記的抗抗體來檢測已經與固態結合的待檢抗體。
競爭法：可用於測定抗原或抗體。以抗原測定為例子，待測抗原和酵素標定抗原互相競爭與固態抗體做結合，所以結合到固態的酵素標定抗原量與待測抗原量呈反比的關係。

ELISA Reader實驗應用

夾心法：利用雙抗體來夾抗原做測定，是檢測抗原最常用的方法。
螢光：A. 細胞活性/毒性檢測。 B. 核酸檢測。 C. 螢光蛋白實驗。 D. 分子探針實驗。 E. 細胞凋亡檢測。 F. 蛋白酶螢光法檢測。 G. cAMP檢測。H. 基於螢光發光的ELISA。
冷光：A. Luciferase分析。 B. ATP檢測。 C. Tyrosine激酶分析。D. DNA探針。 E. 噬菌作用。 F. 微生物分析。 G. Ca²⁺分析。 H. dsDNA分析。 I. 基於化學發光的ELISA。

ELISA Reader使用說明

各共研提供之ELISA Reader廠牌型號不同，歡迎研究人員依實驗需求使用，詳細規格請見醫研部網頁，或洽各共研管理人詢問。
　

共研別共研管理人機型

第二共研劉貞#65760 BIOTEK /μQuant

第三共研歐陽璞#65725 Wallac Victor2

第七共研袁惠萍#63162 PerkinElmer/ Top-count
SpectraMax^® M5

第八共研洪煜堃#63480 TECAN/infinite F200

內毒素動力分析儀

內毒素動力分析儀是一具有溫度控制(Incubator)、可振盪使反應溶液充份混合、可選擇單波長或雙波長（九共使用濾片:405, 450, 490, 630 及 340 nm filter)、搭配96孔盤作業的光譜儀，適用於動力學及終點判定分析實驗。內毒素（endotoxin）是革蘭氏陰性菌細胞壁上的脂多醣類（lipo-polysaccharide, LPS）之複合物，當細菌死亡被溶解之後，內毒素會被釋放出來。典型的脂多醣類(LPS)內毒素是由下列成分所組成：脂質A(lipid A)嵌入細胞壁內、固定不變的多醣類核心(core polysaccharides)及高變異性O-多醣類(O-polysaccharides)，與細菌如沙門桿菌與志賀桿菌之血清型變異性有關，當內毒素通過消化道進入人體時並不產生危害，但內毒素通過注射等方式進入血液時則會引起不同的疾病。

內毒素引起的疾病

內毒素可引起發熱、微循環障礙、內毒素休克及播散性血管內凝血等，因此，生物製品類、注射用藥劑、化學藥品類、放射性藥物、抗生素類、疫苗類、透析液等製劑以及醫療器材類（如一次性注射器，植入性生物材料）必須經過細菌內毒素檢測試驗合格後才能使用。

內毒素常見檢測方法及原理比較

凝膠法(Gel-Clot) 採用Limulus Amebocyte Lysate（LAL）檢測試劑，是最早發展出的內毒素偵測法，也是最早被美國藥典(USP)所採用的方法。凝膠法提供了定性及半定量的試驗結果，有不同敏感度的試劑，常用的有0.03 EU/mL、0.06 EU/mL、0.125 EU/mL及0.25 EU/mL。

第九共研提供動態基質比色法來檢測細菌內毒素(Kinetic-QCL)，是一定量方法，檢測濃度為0.005-50.0EU/ mL。首先將檢體與鱟血試劑作用，產生活化酵素後與加入的發色性胜肽(PNA)作用，最後產生黃色呈色反應；藉由測量反應混合物達到某預先設定的吸光度所需的反應時間，以檢測顏色成形的速度，反比換算出個別濃度。

兩者比較如下:

方法比較	Gel Clot	Kinetic
使用方式
檢驗靈敏度	0.25 EU/ml 0.125 EU/ml 0.06 EU/ml 0.03 EU/ml 擇一款定性試劑	50 EU/ml ~0.00 5EU/ml 定量試驗
適用樣品	水質化學性生物性(低蛋白質) 低酸鹼值	水質化學性生物性(如細胞、微生物性等高蛋白質) 低酸鹼值檢體血液樣品(全血或血清)
測試時間	60min	30~60mins
環境要求	一般實驗室	一般實驗室
標準濃度誤差允收範圍	+100%	+25%
品質控制	依循實驗室準則	FDA 21CFR Part 11.

使用說明

第九共同研究室提供「內毒素檢測儀」，歡迎研究人員自行操作或委託專職技術人員服務。實驗室管理人員為李昇憲先生，分機67834，電子信箱sonny1475@ntuh.gov.tw。若有任何問題，歡迎來電或來信討論。
　

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科學新知

細胞治療近況淺述

吳怡萍博士

細胞治療相關研究於1968年骨髓移植成功案例以後，持續累積骨髓造血幹細胞及間質幹細胞的知識和經驗，統計近12個月中發表的研究文獻(圖一)及全球臨床試驗登錄網絡的記載，目前登錄的300件間質細胞治療臨床試驗案中，半數以上是以骨髓衍生間質幹細胞為治劑，其次以臍帶血，再者為脂肪間質幹細胞，三大主軸佔全數間質細胞治療臨床試驗案的80%。此外以胎盤間質幹細胞為治劑的臨床試驗案也於2013年開始興起，其中Celgene公司以去細胞的羊膜產品Biovance (醫療器材類)上市後，可能成為廣效性的PDA001產品(1, 2)。

圖一. 累計近一年發表的研究報告數量統計資訊。
(摘錄自Stem Cell Research Products - Opportunities, Tools, and Technologies, June 2014)

以治療標的類別觀之，針對癌症及運動神經類疾病的細胞治療臨床試驗達6000案以上，佔該領域試驗案總數的八成以上，其中也包括約40件經基因改良的免疫細胞用以治療多類癌症的第一、二期研究。

參考台灣藥物臨床試驗資訊網，目前在台灣執行中、或即將邀請受試者的臨床試驗(表一)顯示，不少處於尚未開始召募的執行狀態。近十年以來，細胞治療臨床試驗案至少有50件，台大醫院自2005年起也執行數件第I/II期試驗案，隨後歷經試驗執行場地的修繕、品質文件編修等磨練過程，當然許多台灣醫界的研究者或投入細胞治療產業先進所也歷經如此學習路徑，並且累積許多經驗。

表1. 截至2014/08在台灣執行中、或即將邀請受試者的臨床試驗

治療標的condition
試驗藥物 intervention
執行機構sponsor 執行期
execution period 受試人數trial size(p)

陳舊性缺血性腦中風 G-CSF激活自體週邊血幹細胞
中國醫藥大學附設醫院神經精神醫學中心
2008/12 to 2010/11 30

嚴重瀰漫性冠狀動脈疾病自體血管內皮幹細胞
高雄長庚醫院心臟外科
2011/08 to 2014/07 40

小腦退化性動作協調障礙靜脈輸注異體間葉幹細胞台北榮民總醫院 2012/05 to 2014/12 8

末期肝癌由自體樹突細胞刺激擴增後的自體T細胞高雄醫學大學附設中和紀念醫院 2012/03 to 2014/04 12

末期鼻咽癌自體樹突細胞活化過的自體T細胞高雄醫學大學附設中和紀念醫院 2011/04 to 2013/12 12

急性腦中風病臍帶血單核細胞靜脈注射治療中國醫藥大學北港附設醫院 2013/09 to 2014/08 6

缺血性腦中風自體內皮幹細胞(CD34+細胞)
高雄長庚醫院心臟內科
2013/01 to 2015/12 160

固體癌自體樹突狀殺手細胞
富禾生醫/台北榮民總醫院
2013/07 to 2015/07 20

由於資源投入臨床試驗逐期必然增加的趨勢，至今國內尚未有任何一研究機構/公司將細胞產品推展至第三期試驗案，或進入查驗登記的階段，意味該類醫療品的研發路徑的漫長及具挑戰性。反觀，US-FDA所准許的九種細胞治療品(表二) ，對應今年4月中旬衛生福利部食品藥物管理署公告重新修訂人類細胞治療產品臨床試驗申請作業與審查基準（草案），其內容強調現行國際管理規範及實務需求，更參考國際法規進展及食藥署受理申請與審查實務現況，明確揭示細胞治療產品安全性及有效性科學性證據累積的必要性。

表二.美國FDA所核可的含人類細胞的生物製劑類醫療產品(2014/09)

由二戰後六十多年以來醫藥的研究觀察，現今臨床前的研究工具日益精良，提升各類藥品的效能驗證能力及機制的檢證能力。值得一提的是，由2009年英年早逝的中研院研究員李鴻博士及其夫人等四位利用基因剔除(gene knockout)及基因轉殖鼠(transgenic mice)兩項技術配合所建立的世界第一例人類脊髓性肌肉萎縮症之小鼠動物模式 (spinal muscular atrophy, SMA)，代表台灣學者的貢獻。此外學界也倡言精進運用動物的方式(3Rs :替代Replacement，減量Reduction 和精緻化Refinement)，及周密設計試驗和所產生的資訊解讀方法學,進一步彰顯生命的更深層價值。

個人以生物學的視角，細胞治療不只是組織再生的起步，也可能是系統性醫療的另一契機，在進取、展望的同時，也願我等有幸參與其盛者，審慎精研，共同成就事功。

References

Mayer L, Pandak WM, Melmed GY, Hanauer SB, Johnson K, Payne D, Faleck H, Hariri RJ, Fischkoff SA. 2013 Safety and tolerability of human placenta-derived cells (PDA001) in treatment-resistant Crohn's disease: a phase 1 study. Inflamm Bowel Dis. 19:754-60.
Lublin FD, Bowen JD, Huddlestone J, Kremenchutzky M, Carpenter A, Corboy JR, Freedman MS, Krupp L, Paulo C, Hariri RJ, Fischkoff SA. 2014 Human Placenta-Derived Cells (PDA-001) for the treatment of adults with multiple sclerosis: a randomized, placebo-controlled, multiple-dose study. Multiple Sclerosis and Related Disorders (in press).

Web accessible data base:
http://www.clinicaltrial.gov
http://www1.cde.org.tw/ct_taiwan/ TFDA/CDE: 台灣藥物臨床試驗資訊網 clinical trial network in Taiwan

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共同研究室貴重儀器訓練暨研究新知課程　

儀器訓練課程:課程網路報名

	10月15日	流式細胞儀(Coulter Epics XL-MCL)原理與實機示範
	10月21日	流式細胞儀(BD LSR II)實機操作課程
	10月22日	顯微鏡與影像擷取系統之操作教育訓練(NIKON TS-100 & 80i)
	10月29日	即時聚合酶連鎖反應器(ABI 7900HT Fast System)操作訓練課程

研究新知課程:課程網路報名　

	10月03日	Unleash your Translational Medicine with Novel Platforms for Multiplex and Cell Culture
	10月08日	器械預清潔及汙染源去除
	10月21日	Global Research Trending to Hypoxia

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為持續提供優質之研究服務，便於日後聘用專職技術人員、購置新儀器、現有儀器汰舊換新與維護保養等等，敬請於使用共同研究室資源並發表論文時，於論文致謝（Acknowledgement）處加入致謝共同研究室之文句，並於論文發表時通知共同研究室管理人員。致謝文句請依實際使用情形書寫，或請參考以下範例：We thank the staff of the Core Labs, Department of Medical Research, National Taiwan University Hospital for technical support.
　