東京未來式公司 羅際揚 副總 

前言

細胞外基質（extracellular matrix；ECM）是存在於所有組織和器官中的非細胞成分。ECM為細胞成分提供必要的物理性支撐。ECM 是一種三維的大分子網絡，由膠原蛋白、蛋白聚糖和醣胺聚醣 （glycosaminoglycan；GAG）、彈性蛋白和彈性纖維、層粘連蛋白、纖連蛋白和其他蛋白質/醣蛋白（如間質蛋白）組成。這種大分子結構在組織和細胞的調節中扮演著關鍵作用[1]（圖1）。ECM藉由細胞的表面受體來調節細胞的生理、生長、存活、分化和粘附，進而影響組織的形態發生、發育和穩態平衡。

圖1:細胞外基質-細胞相互作用（來源：[2]）

雖然膠原蛋白等纖維蛋白定義了組織的硬度和彈性，但填充了組織大部分間隙空間的蛋白聚糖和GAG，才是ECM中的關鍵角色，因為它們是許多細胞功能的協調者。GAG結構雖複雜，但其結構僅由醣醛酸和己糖胺單元重複組成。玻尿酸（hyaluronan；HA）是唯一的非硫酸化GAG，具有結合和保留水分子的獨特能力，在體內，由於其帶負電荷和親水的性質，HA具有許多生物上功能，例如維持結締組織中的彈性粘度，控制組織水合作用，作為一種蛋白聚醣的組成底物，以及許多在細胞功能和運動中的受體協調作用， 憑藉其廣泛的生物活性，HA還參與病理過程，如腫瘤惡化、發炎反應和傷口癒合[1]。

儘管GAG和HA在健康和疾病中具有重要而多樣的作用，但大多數3D細胞培養物不包含這些存在於ECM的關鍵成分。通常HA基礎的3D水凝膠系統具有非常不足的物理化學性質，並且無法用傳統的細胞培養方法保持其特性。但某些商業廠商(例如：HCS Pharma)擁有生產一種獨特3D水凝膠骨架細胞培養系統，這是一種以HA為基礎的即用型基質，並且可長時間保存。

3D水凝膠骨架^®：創新的3D細胞培養技術

3D水凝膠骨架是一種突破性的即用型3D細胞培養支援工具，具有固體支架和水凝膠之間的雙重特性（因此得名水凝膠骨架™）。此3D水凝膠骨架由天然的ECM成分組成；玻尿酸（主要是GAG），膠原蛋白和粘附蛋白。通過調節這些組成物，例如使用不同類型的膠原蛋白，現在的商業3D水凝膠骨架可以模擬任何欲研究的器官或組織的細胞微環境。由於3D水凝膠骨架的組成和生物物理特性，3D水凝膠骨架可以在體外重現各項人體組織，包括基質結構、細胞組織、細胞間相互作用和細胞-基質相互作用。因此，3D水凝膠骨架是接近原始ECM，是具有可用性、組成穩定性和易用性等優點的去細胞接近天然組織（圖2）。

圖2：3D水凝膠骨架結構與去細胞組織比較的掃描式電子顯微鏡（SEM）

ECM的特性(如成分和硬度)因器官或組織以及纖維化和癌症的病理狀況而異。因此，3D水凝膠骨架可以再現特定的特徵（不同的彈性量可作為硬度的量化指標 - 從0.1KPa到16KPa，和/或量化不同的組成成分），以便特定地再現欲研究的器官/組織的基質微環境。此3D水凝膠骨架已經填注在培養盤上（96孔盤和384孔盤，或可按需使用的格式訂製），為研究人員提供了即用型的格式。目前模擬各式組織環境的3D水凝膠骨架，包含：腦組織環境（用於腦細胞培養），腫瘤組織環境（用於癌細胞培養），肝組織環境（用於肝細胞培養）和脂肪組織環境（用於脂肪細胞培養  ）的3D水凝膠骨架。我們將在下面介紹一些使用模擬腦、腫瘤、肝臟等組織環境的3D水凝膠骨架，將人類誘導多能幹細胞（hiPSC）分化為肝臟類器官和在生物晶片中培養肝細胞的應用。

3D水凝膠骨架的應用

*3D水凝膠骨架在神經科學中的應用：研究帕金森氏症的體外模型

在模擬腦組織環境的3D水凝膠骨架(由HA，RGDS胜肽，膠原蛋白IV和陽離子聚合物組成)，為了促進神經突生長，將基質的彈性量調整為E = 0.1kPa，就像體內的腦一樣。該基質可以3D培養腦細胞（神經元、星形膠質細胞等），包括初代細胞和細胞株。例如，我們在模擬腦組織環境的3D水凝膠骨架中培養了多巴胺能神經元（Luhmes細胞株），其中它們與其它神經突觸形成叢簇狀。有趣的是，當基質硬度增加到1kPa（如腦癌的組織微環境硬度）會導致細胞形成緻密球狀體，便不再像0.1kPa基質那樣帶有神經突觸的叢簇狀結構（圖3）。

圖3：3D水凝膠骨架硬度對 Luhmes 細胞組織的影響。 Hoechst將細胞核染成藍色，而神經突被TUBB3（β3-微管蛋白，也稱為TUJ1）染成綠色。 比例尺 = 200μm。

在模擬腦組織環境的3D水凝膠骨架（0.1kPa）中培養Luhmes細胞株可用於研究帕金森氏症（PD）。事實上，這種疾病的主要特徵是運動癥狀，由中腦腹側的多巴胺能神經元死亡所引起。這種神經退化涉及一些ECM成分的變化，如膠原蛋白和tenascin的增加，以及HA的減少。同時，HA受體CD44增加。更甚者，ECM  參與了路易氏體聚集和PD的神經炎症，包括神經膠質細胞的活化以及形成促進發炎的MMP片段。在這種情況下，將基質微環境納入體外PD模型非常重要。在模擬腦組織環境的3D水凝膠骨架 Brain中  ，分化的Luhmes細胞表達NeuN（成熟神經元的細胞核標記）以及酪氨酸羥化酶（多巴胺能神經元標記）（圖4A和4B）。

圖4：在模擬腦組織環境的3D水凝膠骨架中培養的Luhmes細胞。 A.成熟神經元標記的表達：NeuN和酪氨酸羥化酶（TH）。 B.3D的神經元組織。 細胞核被Hoechst染成藍色，神經突被TUBB3染成綠色。比例尺 = 200μm。

Luhmes細胞對PD的藥理誘導劑（PDi）的暴露表示，模擬腦組織環境的3D水凝膠骨架中的細胞在3D培養之下，其敏感性低於2D培養（圖5）。這可以透過基質-PDi相互作用（如體內）以及與2D培養相比  BIOMIMESYS® Brain中神經元蛋白表達的差異來解釋。

圖5：Luhmes 細胞對帕金森病誘導劑在BIOMIMESYS®腦和2D培養中的敏感性。誤差線 = 掃描式電子顯微鏡。 CL50 = 致死濃度 50%。n=4

由於神經膠質細胞參與神經退化，我們使用按順序的實驗計畫在模擬腦組織環境的3D水凝膠骨架中，按順序進行初代人類星形膠質細胞和Luhmes細胞的共同培養（圖6）。

圖6： Luhmes 神經元和初代人類星形膠質細胞在模擬腦組織環境的3D水凝膠骨架中的共同培養。神經元被染成紅色的TUBB3，星形膠質細胞被染成綠色的膠質纖維酸性蛋白（GFAP）。比例尺 = 200μm。

*3D水凝膠骨架在癌症研究中的應用

儘管為治療癌症做出了相當大的努力和治療方法，癌症仍是全世界死亡的主要原因。許多實體腫瘤從/作為結締組織發展而來，相較於正常的組織ECM，腫瘤細胞外基質（TECM）有膠原蛋白含量增加的表現，並且以周圍環境硬化為特徵[4]。此外，不同的癌症具有不同的基質硬度：例如，胰腺癌的ECM顯示出特別高的硬度[5]。 這種特殊的機械性微環境參與癌症的發生、生長和進展。模擬腫瘤組織環境的3D水凝膠骨架 能夠提供不同硬度的基質（彈性量為1、8和16 kPa），用於在相關條件下培養癌細胞。

鑒於需要有效的抗癌療法，將包括TECM在內的癌組織複雜性納入考慮，將有助於（i）瞭解癌症發展和轉移的機制，以及（ii）更好地預測人類療效方面的結果。

由於許多固體腫瘤與膠原蛋白含量的增加有關，模擬腫瘤組織環境含有HA和第一型膠原蛋白。這種水凝膠骨架允許在受控環境中長時間培養癌細胞（圖7），使體外模型適應重複劑量測試，這在癌症治療領域是相關的。此外，在3D水凝膠骨架中共同培養是可能的（例如癌症免疫療法應用中的癌症與免疫細胞共同培養），以更好地類比癌症狀況並在相關條件下測試藥物或生物製劑。

圖7：模擬腫瘤組織環境的3D水凝膠骨架基質中的結腸癌細胞。左圖，通過掃描電子顯微鏡觀察3D水凝膠骨架中HT29細胞的球體 ; 右圖，在3D水凝膠骨架中隨時間觀察到的HCT116細胞的螢光圖片。

測試藥物在這種環境下的表現顯示，就癌細胞的細胞毒性作用而言，3D培養的預測性較好（圖8）。

圖 8:與2D培養中獲得的 EC50 曲線和體內外推曲線相比，模擬腫瘤組織環境的3D水凝膠骨架中顯示 5-氟尿酸對結腸癌細胞死亡的影響的存活測定（左圖）。模擬腫瘤組織環境的3D水凝膠骨架結果更接近體內情況。

此外，此3D水凝膠骨架還提供384孔盤的格式，可用於藥物篩選，以加速在早期藥物發現中尋找新的候選藥物或生物製劑。

*3D水凝膠骨架在代謝疾病研究中的應用：從hiPSCs到肝臟類器官的開發

通過使用3D水凝膠骨架並增強hiPSC（人類誘導多能幹細胞）產生的肝細胞功能，我們建立了一個新的簡化和專利程式來獲得肝臟類器官[6]。hiPSCs在96孔盤中以較軟的模擬肝臟組織環境的3D水凝膠骨架作培養。

目前商業上所發展的肝臟類器官，不僅是肝細胞，還包括了膽管細胞、星狀細胞和內皮細胞。功能性表徵表現了，與HLC相比之下增強的細胞色素活性、胺碘酮或乙醇療法對脂質堆積的出色藥理學反應、他汀類藥物治療後的 LDL-bodipy 攝取，這些正如人類臨床觀察所預期的一樣。總之，透過獨特而通用的程式生成了功能性肝臟類器官。這種類比ECM微環境的3D體外模型應該有助於以更具相關性的方法類比體內複雜性，從而發現針對心臟代謝疾病等疾病的新有效療法。此外，這種模式可以個人化和自動化，為藥物篩選和個人化醫療提供了新的視角。

圖9：在3D水凝膠骨架中分化的肝臟類器官。灰色左圖：內部基質和類器官的掃描電子顯微鏡圖片。右圖：成熟肝臟類器官的螢光顯微鏡圖片（藍色，細胞核的DAPI染色；綠色，肝細胞染色的白蛋白；紅色; 用於星狀細胞染色的desmin）。

*更進一步：生物晶片中的模擬肝臟組織環境的3D水凝膠骨架

3Rs指南建議使用替代模型代替動物試驗。為了在領域更進一步，透過使用水凝膠骨架的3D器官晶片技術是被提出的解決方案之一。在這個框架中，肝臟晶片是藥物篩選和毒理學測定最有希望的替代品之一。3D水凝膠骨架可以按需求填注在生物晶片中，並用於動態條件下的長期細胞培養。例如，用於在10μL/min流速下的肝細胞株（HepG2 / C3A）培養21天，3D水凝膠骨架孔隙率對流是可通過的 [7] （圖10）。結果顯示球狀體組織，高活力和白蛋白產生，以及細胞功能的增強。總體而言，這些結果突出了3D水凝膠骨架的肝臟晶片模型增進了細胞功能及其在設計用於藥物篩選和疾病研究的肝臟模型的潛力。

圖10：開發一種集成BIOMIMESYS®肝臟的肝臟晶片，模仿肝臟的細胞外基質。

結論和展望

ECM絕對是建立體外組織實驗模型中要處理和考慮的參數，用於正確理解病理條件下的利害關係機制，以及在臨床前研究中正確在體外模型上測試藥物。在臨床前研究和機轉研究中，使用患者來源的細胞或併用iPSCs與類比體內3D水凝膠骨架™將有助於更好地預測臨床環境中的人類結果。

3D水凝膠骨架適用於所有下游分析技術（成像、PCR、西方墨點法、組織學等），為全球研究人員提供3D細胞培養的即用型細胞培養盤。本文有許多參考文獻，但限於篇幅，無法一一列出，欲瞭解更多資訊，請隨時通過 hello@biomimesys.com與我們聯繫，或在我們的網站（www.hcs-pharma.com/biomimesys/）上尋求更多資訊。

參考資料：

1. N. K. Karamanos et al., « A guide to the composition and functions of the extracellular matrix », The FEBS Journal, vol. 288, n^o 24, p. 6850‑6912, 2021, doi: 10.1111/febs.15776.

2. P. Lu, V. M. Weaver, et Z. Werb, « The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer progression », The Journal of Cell Biology, vol. 196, n^o 4, p. 395, févr. 2012, doi: 10.1083/jcb.201102147.

3. L. Wang, J. A. Johnson, Q. Zhang, et E. K. Beahm, « Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering », Acta Biomater, vol. 9, n^o 11, p. 8921‑8931, nov. 2013, doi: 10.1016/j.actbio.2013.06.035.

4. J. A. Eble et S. Niland, « The extracellular matrix in tumor progression and metastasis », Clin Exp Metastasis, avr. 2019, doi: 10.1007/s10585-019-09966-1.

5. T. Armstrong et al., « Type I collagen promotes the malignant phenotype of pancreatic ductal adenocarcinoma », Clin Cancer Res, vol. 10, n^o 21, p. 7427‑7437, nov. 2004, doi: 10.1158/1078-0432.CCR-03-0825.

6. « Strategy for hepatic differentiation of hiPSCs in 3D within BIOMIMESYS », 21305421.6

7. T. Messelmani et al., « Development of Liver-on-Chip Integrating a Hydroscaffold Mimicking the Liver’s Extracellular Matrix », Bioengineering (Basel), vol. 9, n^o 9, p. 443, sept. 2022, doi: 10.3390/bioengineering9090443.

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